直接免疫荧光法对儿童呼吸道病毒感染病原学检测的临床意义

戴淑惠 任小英

（厦门大学附属第一医院检验科，福建 厦门 361003）

直接免疫荧光法对儿童呼吸道病毒感染病原学检测的临床意义

戴淑惠 任小英

（厦门大学附属第一医院检验科，福建 厦门 361003）

目的建立一种快速检测呼吸道病毒感染的方法，了解儿童呼吸道病毒感染的流行特征。方法采用直接免疫荧光法对2012年8月至2013年7月住院的1801例呼吸道疾病患儿鼻咽部抽吸物进行呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、腺病毒检测。结果检测下呼吸道感染的患儿1801例，共检出呼吸道病毒766例，检出率42.5%。呼吸道合胞病毒（RSV）是儿童下呼吸道感染最常见的病原体，婴幼儿最高，通常在冬春季节流行。结论直接免疫荧光法具有快速、简便、特异性高等优点，适应于呼吸道病毒感染的早期诊断。

直接免疫荧光法；呼吸道病毒感染；儿童

呼吸道病毒是指一类能侵犯呼吸道并引起呼吸道局部病变的病毒，呼吸道合胞病毒（RSV）、流感病毒A、B型、副流感病毒1、2、3型、腺病毒（ADV）感染是多数急性下呼吸道感染的常见原因[1]。其中，多种病毒具有感染力强，潜伏期短，发病急等特点，且病原学复杂，精确的病原学分析不仅是确诊依据，也是合理选择治疗方案的基础[2]，因此能快速检测呼吸道病毒对临床及时诊断和疫情报告有重要意义。本文采用Chemicon呼吸道病毒诊断试剂对诱导痰脱落纤毛柱状上皮细胞中呼吸道病毒抗原进行染色，从而更加快速和灵敏检测呼吸道病毒，达到快速诊断、特异性高、敏感性高的目的。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

2012年8月至2013年7月在本院确诊为下呼吸道感染住院的患儿1801例，年龄1 d～14岁，男1125例，女676例。

1.2 设备及试剂

荧光显微镜（OLYMPUS IX71）、离心机（ALLEGRA X-15R）、37 ℃培养箱，漩涡混合器，美国DHI公司提供的Chemicon呼吸道病毒诊断试剂盒，包括：①荧光标志的单克隆抗体：针对RSV、ADV、FLU-A、FLU-B、副流感1、2、3型；②浓缩洗涤液（40X）；③封闭液；④病原体对照玻片：分别含有病毒感染细胞的阳性对照和没被感染的细胞的阴性对照。

1.3 检测方法

1.3.1 样本收集与处理：①由专职护士将植绒拭子从鼻孔插入鼻腔，到达鼻咽部，来回旋转2～3次后迅速抽出拭子，放入微生物转运液的试管中。②将植绒拭子样本在漩涡混匀器上轻微混匀3下（约30 s）见浑浊后去掉植绒拭子，300～500 r/min，离心10 min 。弃去上清液，留约100～150 μL，吸管吹打混匀，形成混浊细胞悬浮液。

1.3.2 样本制片：样本点样在载玻片上（10～15 μL），电吹风机冷风下风干10～15 min至干燥，浸没在冷丙酮中固定10 min，取出晾干。

1.3.3 免疫荧光染色：①在标本片和对照玻片点加上1滴相应的荧光抗体（约25 μL），必须完全覆盖待测样本。②将载玻片放在湿盒中置于37 ℃培养箱孵育15～30 min。③载玻片用PBS冲洗一遍，后浸没在PBS中洗两遍（PBS不能重复使用）。④除去多余的洗液，在载玻片中央加一滴封闭液，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察。

1.3.4 诊断原则与判断标准：①诊断原则：FITC标记的某病毒特异性单克隆抗体与细胞中相应的病毒抗原结合后，形成抗原抗体复合物，荧光显微镜下细胞内显示苹果绿荧光。而未发生抗原抗体特异性反应的细胞，被Evans蓝染成红色。②阳性结果判断：显示苹果绿荧光的细胞，为阳性细胞。当放大倍数为200倍时，在视野中找到≥2个阳性细胞，判为标本阳性。不同种类的病毒感染的细胞在染色上略有差异，具体情况如下，流感病毒A型/流感病毒B型：胞质颗粒型；细胞核均质型。呼吸道合胞病毒：胞质颗粒型，合胞体中亦可见小块包涵物染荧光。腺病毒：胞质颗粒型；细胞核均质型。副流感病毒1/2/3型：胞质颗粒型。

2 结 果

2.1 病毒检出率与季节的关系

见表1。

表1 病毒检出率与季节的关系

2.2 病毒检出率与年龄的关系

见表2。

表2 病毒检出率与年龄的关系

3 讨 论

呼吸道感染是一种常见病、多发病，一直影响着人们的身体健康，尤其是对免疫力较为低下的婴幼儿，病原体感染容易使婴幼儿引发支气管炎、肺炎、心肌炎等。引起呼吸道感染的病原体种类繁多，引起的病情复杂，临床症状多样，因此，对于引起呼吸道感染的呼吸道病原体的准确诊断将变得十分重要。目前诊断病毒感染方法较多，但都存在不足。电镜检测虽是直接检测病毒颗粒，但检出阳性率不高，检测时间长，不适合临床快速诊断。病毒分离能客观反映所感染病毒的存在及种类，但费时、费力，标本内所含的病毒数量少，会出现假阴性，不利于病毒的快速诊断。病毒核酸检测应用杂交或聚合酶链反应技术，敏感性强，特异性高，能进行微量检测，但实验条件要求严格，成本高，不适合广大基层医院，同时，不能避免出现假阳性或假阴性。另外，特异性IgG和IgM抗体检测是被感染机体对所感染的病毒产生的一类特异性抗体，但特异性IgG抗体阳性只能表明有相应病毒感染，却不能作为病毒感染急性期和活动期的诊断标准。而IgM类抗体是被感染机体在病毒感染早期或潜伏病毒活化时产生的特异性抗体[3]，虽然IgM抗体不能通过胎盘，故无被动抗体存在，但婴幼儿可因免疫反应较弱而出现假阴性。有文献指出，目前用于诊断呼吸道病毒感染的方法中抗原较抗体检测更敏感[4]。用免疫标记技术直接检测体液和组织中病毒抗原是一种快速而实用的方法。这种方法要求标本中含有一定量的抗原和高质量特异单抗。有报道，选用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法（APPAAP）[5]，APPAAP法虽然可检测病毒抗原，但由于操作步骤过多而易出现非特异性着色，阳性结果很难判断。而荧光免疫技术已发展了二十多年，是一种快速而准确的方法[6]，本文采用的直接免疫荧光法与以往采用的间接荧光免疫法不同的地方在于，它减少了间接法中二抗的非特异性反应，从而提高其特异性。本方法应用呼吸道诱导痰进行病毒抗原检测达到诊断目的。本文的Chemicon呼吸道病毒诊断试剂经过WHO3个参考中心审评，结果良好[7]，特异性可达86%，敏感性达95%[8]。本文结果得出呼吸道合胞病毒（RSV）是儿童下呼吸道感染最常见的病原体，婴幼儿最高，通常在冬春季节流行[9]。本法需时较短，标本在送到实验室2h内就可得出结果，而设备仅需荧光显微镜，在普通实验室即可开展，是一种快速、简便、特异性和敏感性高的诊断呼吸道病毒感染的方法

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1671-8194（2014）16-0147-02