度他雄胺对人前列腺癌PC-3细胞移植裸鼠成瘤预防效应与机制研究*

周仕轶 李俊涛张蜀武

成都中医药大学临床医学院/附属医院（成都 611137）

度他雄胺对人前列腺癌PC-3细胞移植裸鼠成瘤预防效应与机制研究*

周仕轶 李俊涛**张蜀武

成都中医药大学临床医学院/附属医院（成都 611137）

目的探讨新型5α还原酶抑制剂——度他雄胺对人前列腺癌PC-3细胞裸鼠移植瘤的成瘤预防效应与机制。方法选取BALB/C裸鼠30只，随机平均分为度他雄胺组、非那雄胺对照组和阴性对照组，均采用皮下注射人前列腺癌PC-3细胞建立移植瘤模型，同时度他雄胺组裸鼠每日腹腔注射度他雄胺含药血清，非那雄胺组每日腹腔注射非那雄胺含药血清，阴性对照组每日腹腔注射非含药血清。给药30d内，观察实验期间各组动物移植瘤生长曲线，移植瘤倍增时间，成瘤百分率。30d后处死动物，免疫组化法结合图像分析各组裸鼠瘤体ECM降解程度，RT-PCR法检测细胞外基质-整合素（ECM-integrin）跨膜信号通路关键蛋白integrinβ1，β2和β6的表达情况。结果实验期间各组裸鼠移植瘤成瘤率均为100%，移植瘤生长曲线近似，与阴性对照组相比，度他雄胺和非那雄胺组移植瘤成瘤平均潜伏期延长（P＜0.05），度他雄胺组肿瘤倍增时间比阴性对照组和非那雄胺组延长，差异具均统计学意义（P＜0.05）。免疫组化检测度他雄胺组和非那雄胺组瘤体ECM较阴性对照组明显降解，表现为纤维链接蛋白（FN）和胶原（CL）表达明显降低（P＜0.01或P＜0.05），基质金属蛋白酶-2（MMP-2）表达明显增强（P＜0.01或P＜0.05）；RT-PCR法检测度他雄胺组瘤体细胞integrinβ1和β6表达较阴性对照组明显降低（P＜0.01或P＜0.05），integrinβ1 表达较非那雄胺组降低（P＜0.05），结论 度他雄胺能通过降解人前列腺PC-3细胞裸鼠抑制瘤ECM，降低integrinβ1和β6表达，从而抑制决定前列腺癌细胞生长、增殖和转移的关键信号通路-ECM-integrin信号通路，从而延长移植瘤成瘤和倍增时间，但不能有效抑制成瘤率，因此尚不能明确其具有预防前列腺癌的作用，同时也说明前列腺癌形成和生长机制具有多重复杂性。

度他雄胺; PC3细胞; 前列腺肿瘤; 小鼠,裸

前列腺癌（Prostate Cancer, PCa）是老年男性常见肿瘤，美国2013年癌症统计数据表明该病预计发病率仍居所有肿瘤疾病的第一位，死亡率也仅次于肺癌位于肿瘤疾病第二位[1]，严重危害男性健康。在我国，PCa也是发病率和死亡率增长最快的肿瘤，并且由于早期诊断技术未能普及，形成了低于全球发病率的假象[2]，并呈现高MR/IR（死亡率/发病率）比的现象[3]。

目前，针对PCa的治疗复杂多样，疗效随病程进展而逐渐下降，因此对PCa预防，特别是化学（药物）预防的研究成为了热点。度他雄胺（Dutasteride）是新型5α还原酶抑制剂（5ARI），具有同时抑制5ARⅠ和5ARⅡ的双重作用，临床报道用于预防PCa有效，但同时存在增强Gleason高分级PCa发病风险的争议。本研究利用体外细胞培养和裸鼠皮下注射移植瘤等方法，观察度他雄胺对裸鼠移植瘤成瘤的预防效果，及其对PCa形成、增殖和转移起关键作用的ECM-integrin（细胞外机制-整合素）跨膜信号通路的影响，探讨其预防PCa的效应和机制。

材料和方法

一、实验药物及配制

度他雄胺软胶囊，由葛兰素史克公司生产，规格0.5mg/粒，国药准字H20110205，生产批号35826003。将胶囊去壳，内含白色粉末溶于生理盐水制成溶液。

非那雄胺片（Finasteride），由杭州默沙东制药有限公司生产，规格5mg/粒，国药准字J20090145，生产批号130321。将片剂研磨成极细粉末，溶于生理盐水制成溶液。

二、细胞培养

人前列腺癌PC-3细胞，由中科院昆明细胞库提供，该细胞株不具有可检测的雄激素敏感性，为雄激素非依赖性细胞。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液置于37℃、5%CO2的孵化箱内培养、传代，每周传代3次，传代比为1:3，直至细胞数量达到实验要求。

二、实验动物及造模

（一）含药血清提取

成年雄性SD大鼠45只，2月龄，体质量200～250g，由成都中医药大学实验动物中心提供（认证编号：川实动管质第9号）。大鼠随机分成3组，每组15只。3组大鼠分别灌胃度他雄胺溶液0.083mg•kg-1•d-1（相当于成人日剂量的10倍），非那雄胺溶液0.83mg•kg-1•d-1（相当于成人日剂量10倍）和等容生理盐水，连续5d。腹主动脉取血，分离足够度他雄胺和非那雄胺含药血清及非含药血清。

（二）裸鼠及造模

雄性BALB/C裸小鼠30只，8～10周龄，体质量20～ 22g，提供方同上。按文献报道造模方法[4]，待PC-3细胞处于对数生长期，且浓度达到2×107个/mL时收集细胞并制成混悬液，调节好细胞浓度为5×107个/mL 的PC- 3细胞共2.5mL，以1mL注射器抽取细胞悬液， 每只裸鼠接种0.2mL， 接种细胞量约为1×107个，接种部位为裸鼠颈背皮下， 接种前用碘复消毒裸鼠皮肤。

三、实验分组和给药

注射造模裸鼠随机分为度他雄胺组、非那雄胺组和阴性对照组，每组30只。在注射后移植瘤生长期同时做腹腔注射给药，度他雄胺组腹腔注射大鼠30%度他雄胺含药血清0.2mL•kg-1•d-1；非那雄胺组腹腔注射大鼠30%非那雄胺含药血清0.2mL•kg-1•d-1；阴性对照组腹腔注射30%大鼠无药血清0.2mL•kg-1•d-1，连续30d。

四、移植瘤成瘤观察

（一）移植瘤生长曲线观测

细胞移植和给药10d后，每3天测量1次肿瘤长径（b），短径（a），按公式V = 1/6（πab2）计算肿瘤体积，共观察20d，并绘制生长曲线图，并计算成瘤潜伏期。

（二）肿瘤体积倍增时间（TD）

TD = 0.1×t /（logDt-logDo）， Do为第一次测得的肿瘤直径，Dt 为经过t时间后测得的肿瘤直径。

成瘤率的计算：成瘤百分率= （接种成功只数/接种总数）×100%。30d后，处死裸鼠，分离颈部移植瘤，大体观察移植瘤的形态、体积、颜色及与周围组织的关系。

五、ECM降解观察

纤维连接蛋白（FN）、羊多克隆抗体（goat polyclonal IgG）和基质金属蛋白酶-2（MMP-2）羊多克隆抗体（goat polyclonal IgG）均购自Santa Cruz Biochemistry公司。以上相应二抗及试剂盒购自北京中杉生物技术有限公司。将度他雄胺组、非那雄胺组和阴性对照组分离移植瘤组织进行病理切片，免疫组化染色，胶原（CL）用Masson染色，运用MIAS-2000型图形图像分析系统对染色结果进行分析，观测各指标的面积、积分光密度和平均光密度。

六、RT-PCR法对ECM-integrin信号通路关键蛋白观察

（一）细胞总RNA提取

提取各组移植瘤细胞，用Trizol法裂解细胞，按比例加入氯仿，离心管混匀。室温静止分层后，40℃ 1 200×g，离心15min。在离心管中按比例加入室温下75%乙醇，7 500×g，离心5min，弃上清液。室温下静止5～ 15min，细胞RNA沉淀干燥，溶解后，-70℃保存。

（二）PCR基因表达产物扩增

1. 取5mL RNA样本做凝胶电泳，以确定提取RNA的量是否达到反转录要求。

2. 将RNA反转录为cDNA，参照AMV Reverse Transcriptase（Ferment）操作程序进行RNA的反转录反应，各检测基因引物序列与片段长度见表1。

表1 各引物序列与片段长度

3. PCR基因扩增，按反应体系加入相关试剂和引物，反复尝试摸准PCR反应条件后，取PCR产物5μL 1%琼脂糖凝胶电泳80V，100mA，30min。采用Greenview染色，用全自动凝胶成像仪成像，并分析结果，以β-actin为内参照标准进行半定量分析。分析系统测定各特异产物条带和内参照的强度，计算特异扩增产物的相对量，计算公式为：特异扩增产物的相对量=特异条带的强度/内参照的强度×100%。

七、统计学方法

所有资料均采用SPSS 19.0进行统计学处理，结果以均数±标准差（±s）表示。各组间比较采用单因素方差分析，其中方差齐者用LSD法，方差不齐者用Dunnett's检验。

结 果

一、度他雄胺对裸鼠移植瘤成瘤的影响

各组裸鼠移植瘤成瘤潜伏期和肿瘤倍增时间见表2。结果显示：度他雄胺组和非那雄胺组成瘤潜伏期比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。这两组与阴性对照组比较，均有效延长，差异均有统计学意义（P＜0.05）。度他雄胺组裸鼠肿瘤倍增时间较阴性对照组和非那雄胺组延长，差异均具统计学意义（P＜0.05)。最终各组裸鼠成瘤率均为100%。各组裸鼠移植瘤生长曲线近似，见图1。经30d试验后处死裸鼠，剥离移植瘤观察各组移植瘤瘤体形态近似，包膜均完整，均无向周围组织浸润生长现象，各组瘤体体积比较无统计学差异，见表2。各组瘤体剖面观察呈粉红色，中间有部分坏死灶。各组瘤体分离细胞经染色镜下观察具有肿瘤细胞特征。

图1 各组裸鼠移植瘤生长曲线图

表2 各组裸鼠移植瘤平均成瘤潜伏期、肿瘤倍增时间和瘤体体积比较（±s）

表2 各组裸鼠移植瘤平均成瘤潜伏期、肿瘤倍增时间和瘤体体积比较（±s）

注：与阴性对照组相比,*P＜0.05; 与非那雄胺组比,△P＜0.05

组别 成瘤平均 肿瘤平均 30d肿瘤潜伏期(d) 倍增时间(d) 平均体积(mm3)阴性对照组 18±3.0 9±1.1 2339.5±233.7度他雄胺组 19±3.1*10±0.9*△2298.6±245.4非那雄胺组 19±3.7*9±1.3 2341.0±220.8

二、度他雄胺对裸鼠移植瘤ECM的降解作用

CL是ECM含量最多的成分，经Masson染色后呈蓝紫色；FN能促进ECM各类成分的结合并沉积，经免疫组化染色后阳性表达呈黄褐色；MMP-2具有降解前两者的作用，经免疫组化染色后阳性表达呈黄褐色。三者结合可作为观测药物对ECM降解作用的综合指标，通过MIAS-2000图像分析系统，可从面积、积分光密度和平均光密度3个指标来分析三者的表达量。结果与阴性对照组相比，度他雄胺和非那雄胺组能降低CL和FN的面积、积分和平均光密度，并增强MMP-2相关指标的作用（P＜0.01或P＜0.05），两组间比较无统计学差异（P＞0.05），表明度他雄胺和非那雄胺均具有降解裸鼠移植瘤ECM的作用。各组CL、FN和MMP-2面积、积分和平均光密度比较见表3和图2。

图2 各组移植瘤CL、FN和MMP-2阳性表达

表3 各组CL、FN和MMP-2的面积，积分和平均光密度比较（±s）

表3 各组CL、FN和MMP-2的面积，积分和平均光密度比较（±s）

注：与阴性对照组相比，P＜0.05，P＜0.01

CL FN MMP-2组别 面积 积分光密度 平均光密度 面积 积分光密度 平均光密度 面积 积分光密度 平均光密度(μm2) (IU) (IU) (μm2) (IU) (IU) (μm2) (IU) (IU)阴性对照组 221.17±13.38 3347±223.6 78.66±14.06 142.34±16.09 876.21±93.44 81.22±9.11 3.05±0.42 24.65±0.32 6.87±0.56度他雄胺组 197.35±9.87**3059±151.7**67.04±13.58**136.67±11.47**853.23±93.19*70.69±9.03*3.66±0.40*29.77±0.37*7.25±0.50*非那雄胺组 199.82±9.36**3118±159.2**67.02±13.49**139.95±12.36*848.77±94.17*73.35±8.73*3.43±0.34**29.48±0.30*7.38±0.61****

三、度他雄胺对裸鼠移植瘤ECM-integrin信号通路的作用

度他雄胺在有效降解移植瘤ECM后，与阴性对照组比较，对integrinβ1和integrinβ6表达呈抑制作用（P＜0.01或P＜0.05），与非那雄胺组比较，对integrinβ1抑制作用更佳（P＜0.01）。各组对integrinβ1，integrinβ2和integrinβ6表达影响结果见表4和图3至图5。

表4 各组integrinβ1，integrinβ2和integrinβ6表达量比较（±s）

表4 各组integrinβ1，integrinβ2和integrinβ6表达量比较（±s）

组别 integrinβ1 integrinβ2 integrinβ6表达量 表达量 表达量阴性对照组 0.337±0.021 0.641±0.048 0.616±0.055度他雄胺组 0.055±0.006**△0.633±0.044 0.565±0.047*非那雄胺组 0.203±0.018**0.650±0.039 0.577±0.049*

注：与阴性对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与非那雄胺组相比,△P＜0.01

图3 各组移植瘤细胞integrinβ1表达PCR扩增图

图4 各组移植瘤细胞integrinβ2表达PCR扩增图

图5 各组移植瘤细胞integrinβ6表达PCR扩增图

讨 论

一、实验对象选择

（一）实验药物选择

度他雄胺是新型5ARI，具有同时抑制5ARⅠ和5ARⅡ的双重作用，已由美国FDA批准上市，主要用于治疗前列腺增生症（BPH）和雄性脱发等病。目前度他雄胺用作药物预防PCa的研究成为热点，对诸如REDUCE实验（度他雄胺降低前列腺癌发病风险实验）等大规模临床实验的综合分析表明，BPH病人长期持续服用度他雄胺可以降低低分级PCa的发病风险，并有助于治疗性诊断高分级PCa，因此被视为PCa预防的里程碑[5]。循证医学资料也表明，相比坦索罗辛对照组和安慰剂组，度他雄胺能有效降低BPH合并PCa高发病风险患者的PCa患病率（MHRR: 0.66, 95% CI 0.52-0.85）[6]；但也有资料显示，度他雄胺可能会增加高分级PCa的发生风险[7]。目前，度他雄胺预防PCa的研究也主要见于上诉临床研究，但预防机制实验研究未能查见，尚属研究空白。因此本研究选择度他雄胺为研究对象，拟揭示其预防PCa的实验效应和机制。

（二）对照药物选择

非那雄胺是5ARⅡ抑制剂，临床用于治疗BPH，与实验药物属于同类药物，但作用范围不及度他雄胺。临床PCPT（前列腺癌预防实验）研究[8]和循证医学资料均显示[9]，非那雄胺具有降低PCa发病率的作用，与对照组相比，合并OR=0.68，降低发病风险32%。因此非那雄胺作为本研究的对照药物，能同时探讨并比较实验和对照药物预防PCa的效应和机制。

二、ECM-integrin信号通路

细胞外基质-整合素细胞生存通路（ECM-integrin cell survival pathway）是PCa细胞失巢凋亡调控的关键机制之一，它的激活能促使细胞在脱离与ECM黏附后继续生存[10]，从而促成PCa的最终形成，生长，侵袭和转移。ECM与上皮细胞的相互作用能介导integrin依赖性分子激活（其中integrinβ1, β2和β6最重要，被发现在PCa发生和转移进程中明显上调[11]），被激活的分子通过介导FAK（Focal adhesion kinase, 黏着斑激酶）激活，继而激活Src基因族，Src再激活PI3K/Akt（磷脂酰肌醇3-蛋白激酶B）信号通路，促使细胞增殖和凋亡逃避，或通过介导ILK-1（Integrinlinked kinase1,整合素链接激酶1）激活，ILK1激活后可介导GSK3β（Glycogen synthase kinase3β，糖原合成激酶3β）激活并募集Snail基因族，然后通过级联效应激活PI3K/Akt信号通路，最终促使细胞在脱离ECM后生存并再与其他ECM黏附，促使PCa的生成。通过前期研究，我们已经证实PI3K/Akt信号通路受到抑制，将会促使人前列腺癌DU-145细胞增殖抑制和凋亡[12]。因此，ECM-integrin信号通路是调控PCa生成和转移的关键上游分子机制。通过前期研究，我们也证实了非那雄胺具有通过抑制CL和FN表达，增强MMP-2表达从而降解ECM的作用[13]。因此本研究正基于非那雄胺能降解ECM，从而推测其同类新型药物度他雄胺也能降解ECM，两种药物降解ECM后导致ECM-integrin信号通路不能激活，其下游分子机制失效，从而使PCa不能形成、增殖、侵袭和转移的假设而立论的。

三、问题与展望

通过本研究，我们揭示了度他雄胺能通过降解人前列腺PC-3细胞裸鼠抑制瘤ECM，降低integrinβ1，β2和β6表达，从而抑制决定前列腺癌细胞生长、增殖和转移的关键信号通路——ECM-integrin信号通路的作用。但各组裸鼠移植瘤最终均能成瘤，度他雄胺仅表现为能延迟移植瘤平均成瘤时间和肿瘤倍增时间，因此尚不能说明其具有预防前列腺癌的作用，这与大多数临床研究文献的报道存在一定矛盾。同时，由于其能降解ECM，特别是MMP-2表达受到抑制后，会导致肿瘤细胞易于在瘤体中活动，而获得侵袭和转移的能力，这也印证了对其会增加高分级PCa发生的担忧。本研究移植瘤并非位于实验动物的前列腺，因此度他雄胺和非那雄胺降解ECM和调控ECM-integrin的作用是否充分发挥，也还难以完全阐明。

今后，还应进行大样本和长期随访的临床研究来充分揭示度他雄胺对PCa的发病风险的抑制作用。由于PCa的发生机制具有多样复杂性，药物预防PCa的效应和机制还应成为研究热点，以便为药物临床应用提供理论支持和方法指导。

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（2014-02-28收稿）

Prevention effects dutasteride on human prostate cancer PC-3 cells transplanting tumors in nude miceand its mechanism

Zhou Shiyi, Li Juntao**, Zhang Shuwu Clinical Medical College of Chengdu University of TCM/Aff liated Hospital of Chengdu University of TCM, Chengdu 611137, China

ObjectiveTo investigate the prevention effects of new type 5α reductase inhibitor-dutasteride on human PC-3 cells transplanting tumors in nude mice and explore its mechanism.MethodsHuman prostate cancer cells PC-3 were transplanted subcutaneously around 30 nude mice’s necks to establish transplanting tumor models. Then 30 nude mice were divided randomly and evenly into the dutasteride group(treated with intraperitoneal injection of dutasteride serum), the fenasteride group(treated with intraperitoneal injection of fenasteride serum) and the control group (treated with intraperitoneal injection of no durg serum). The tumor growth curve, tumor double time and tumor formation rate were measured during 30 days administration . The immunochemistry and MIAS image analysis were applied to investigate ECM degradation and RT-PCR was applied to measure the expression of integrin β1, and β6 after 30 days of transplantation.Results The tumor growth curves of three groups were similar. Dutasteride could prolong tumor double time as compared with the other 2 groups but there was no statistical signif cance (P>0.05). Both dutasteride and fenasteride could degrade tumor ECM by inhibiting the expression of CL and FN (P<0.01 or P<0.05), and enhancing MMP-2 expression (P<0.01 or P<0.05) compared with the control group. Dutasteride could inhibit integrin β1 and β6 expression (P<0.01 or P<0.05) and had the inhibiting trend of integrin β2 (P>0.05) compared with the control group.ConclusionDutasteride can inhibit ECM-integrin signal pathway by degrading ECM and inhibiting the expression of integrinβ1 and β6. Even so, it can only prolong the tumor formation and double time but can not prevent the formation of human PC-3 transplanting tumor in nude mice. Thus the present data can not supportthat dutasteride has the prevention effect on PCa, but reflecting the complicatedprinciples of PCa formation.

Dutasteride; PC3 cells; prostatic neoplasms; mice, nude

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.003

R 737.25

资助: 四川省卫生厅2012年立项资助科研课题（编号：120466）**为在读博士研究生