锌对辣椒素致痛模型小鼠脊髓磷酸化ERK表达和热痛阈的影响

王月静，刘晓露，李富兴，韩言秀，张 莉

辽宁医学院 组织学与胚胎学教研室，辽宁锦州 121001

锌对辣椒素致痛模型小鼠脊髓磷酸化ERK表达和热痛阈的影响

王月静，刘晓露，李富兴，韩言秀，张 莉

辽宁医学院 组织学与胚胎学教研室，辽宁锦州 121001

目的研究锌对辣椒素致痛模型小鼠脊髓磷酸化(p)的细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulate kinase，ERK)表达和热痛阈的影响。方法72只C57/BL6小鼠随机分为4组，采用足底注射辣椒素(0.5%，5 μl)制备神经病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)动物模型：对照组(Con)锌饲料30 mg/(kg·d)喂养2周后足底注射溶剂(吐温80、酒精和0.9%氯化钠注射液混合液)；N-NPP组锌饲料30 mg/(kg·d)喂养2周后给予足底注射辣椒素，L-NPP组锌饲料0.85 mg/(kg·d)喂养2周后注射辣椒素，H-NPP组硫酸锌水溶液227 mg/(L·d)喂养2周后注射辣椒素。应用动物行为学检测、免疫组织化学、免疫印迹和图像分析技术检测注射后7 d锌对动物行为学以及脊髓pERK表达的影响。结果高锌喂养能显著降低脊髓pERK的表达，降低痛敏，使热痛阈增高(P＜0.01)；而低锌喂养能增加脊髓pERK的表达，增加痛敏，使热痛阈降低(P＜0.01)。结论锌能抑制辣椒素致痛模型小鼠脊髓pERK的表达和热痛觉过敏。

锌；神经病理性疼痛；脊髓；磷酸化；细胞外信号调节激酶

神经病理性疼痛(neuropathy pain，NPP)是由于躯体感觉系统损伤或疾病引起的慢性疼痛。NPP患者的主要临床特征表现为自发性疼痛、感觉缺失、痛觉过敏和触诱发痛等，给患者带来极大的痛苦，严重影响其生活质量[1-2]。细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulating kinase，ERK)激活是NPP的重要发病机制之一，在众多疼痛模型中均发现ERK磷酸化水平上调，因此其也经常作为检测痛敏的一个重要指标[3-4]。研究发现，锌与NPP的产生与传导密切相关，但其具体机制尚不清楚[5-6]。本研究利用动物行为学检测、免疫组化、免疫印迹和图像分析技术，观察锌对辣椒素致痛模型脊髓pERK表达以及动物行为学的影响，为进一步揭示锌影响NPP的机制提供基础理论依据。

材料和方法

1 动物分组与模型制备 72只C57/BL6小鼠随机分4组：采用左后足足底注射辣椒素(0.5%，5 μl)制备NPP模型。1)对照组：正常动物足底注射溶剂(吐温80、乙醇和0.9%氯化钠注射液混合液)；2)N-NPP组：适锌饲料[锌：30.0 mg/(kg·d)]喂养2周后注射辣椒素；3)L-NPP组：低锌喂养[锌：0.85 mg/ (kg·d)]2周后注射辣椒素；4)H-NPP组：高锌喂养[饮用硫酸锌水溶液，227 mg/(L·d)]2周后注射辣椒素。

2 主要试剂与仪器 兔抗小鼠多克隆pERK抗体和山羊抗兔IgG多克隆抗体购自Cell Signaling公司；免疫组织化学染色试剂盒和DAB染色剂购自福州迈新公司；GAPDH鼠单克隆抗体购自康成生物公司；辣椒素、ECL试剂盒和胶片购自Santa公司；PVDF膜和蛋白Marker购自NEB公司；光学显微镜和计算机图像分析系统等。

3 取材与标本制备 足底注射辣椒素后第7天，将各组小鼠经4%硫喷妥钠50 mg/kg腹腔麻醉后，取腰5节段脊髓，一部分称重后，-80℃保存，用于免疫印迹检测；一部分经4%多聚甲醛固定12 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，制备5 μm厚的石蜡切片，用于免疫组织化学染色。

4 免疫组织化学染色检测pERK在脊髓的表达 石蜡切片常规脱蜡水化，微波修复。3% H2O2孵育10 min；PBS冲洗，5 min×3次；正常非免疫动物血清孵育10 min；兔抗小鼠多克隆pERK抗体(1∶200)，4℃孵育过夜；PBS冲洗，5 min×3次；山羊抗兔IgG(1∶200)室温下孵育10 min；PBS冲洗，5 min×3次；链霉素抗生物素-过氧化物酶孵育10 min；PBS冲洗，5 min×3次；DAB显色5 min，常规脱水、透明和封片，光镜下观察。用正常非免疫动物血清代替一抗作为阴性对照。

5 免疫印迹技术检测pERK在脊髓的表达 脊髓组织称重后剪碎，加入裂解液，进行超声波粉碎，4℃过夜，低温离心取上清液。测蛋白浓度，沸水浴煮5 min，离心备用。制备分离胶，加样，SDSPAGE电泳，转膜，染膜，封闭，加一抗：兔抗小鼠多克隆pERK抗体(1∶500) 4℃孵育过夜，TBST漂洗，5 min×3次，加二抗(山羊抗兔IgG，1∶5 000)孵育2 h。TBST漂洗，5 min×3次，ECL发光，X线片曝光、显影、定影，计算机图像分析。

6 动物行为学观察 从注射辣椒素前2 d开始，每天观察小鼠的行为学变化，观察有无跛行、注射侧后足不敢着地负重、舔足、咬足、足部畸形、自噬、离地时间延长等现象，一直观察到注射辣椒素后第7天。

7 热痛觉过敏实验 将小鼠放在一块透明的玻璃板上，四周用透明的玻璃封闭，等小鼠对周围的环境适应之后再进行检测。在玻璃板的底部，将光源照射在小鼠注射辣椒素侧的后足足底所接触的玻璃板上，记录从照射开始到小鼠出现抬足或甩足的时间，每只小鼠观察3次，每次间隔5 min，计算平均值作为热刺激缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，即热痛阈[7]。记录注射辣椒素前2 d和注射后第7天的痛阈。

8 图像分析pERK在脊髓的表达 用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统对免疫组化和免疫印迹结果进行图像分析。每个样本选取5张切片，每张切片于400倍光镜下系统随机选取3个视野进行检测，计算平均光密度值(average optical，AO)。

9 统计学处理 应用SPSS软件进行统计处理，实验数据用表示，采用单因素方差分析(ANOVA)方法进行数据分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠行为学变化 足底注射辣椒素后第1天即表现出伤侧脚趾外翻并拢，走路费力甚至出现跛行，患肢不能抬起也不敢着地，最常见的状态是患足悬空而立并缩至腹部，有时还会出现舔舐患肢及甩足的情况，小鼠明显不如注射之前活跃，此种行为持续到检测期末。其中，低锌喂养(L-NPP)组小鼠跛行、舔足、甩足和不敢负重等现象最为严重，而高锌喂养(H-NPP)组小鼠的行为学改变最轻。热痛阈检测显示：与注射辣椒素前相比，各组动物注射辣椒素后7 d的痛敏增强，热刺激缩足反射潜伏期均显著降低。其中，L-NPP组最低，H-NPP组最高(P＜0.01)。见图1。

图 1 各-组小鼠注射辣椒素前后热刺激缩足反射潜伏期比较(n=24, x±s, s)(a P＜0.01，与注射前比较；b P＜0.01，各组间比较)Fig. 1 Com par-ison of therm al withdraw al latency in each group (n=24, x±s, s)(a P＜0.01, vs before injection; b P＜0.01 vs each group)

2 pERK免疫组化阳性表达比较 pERK免疫组织化学阳性产物呈棕褐色颗粒状，主要表达在脊髓神经元的细胞核上。对照组动物在脊髓后角浅层有少量的阳性表达产物，阳性细胞较少。与对照组相比，其他3组NPP动物的pERK阳性表达均增多，阳性细胞密集，平均光密度值增高(P＜0.01)。其中，L-NPP组的阳性颗粒和阳性细胞最密集，AO值最高；H-NPP组的阳性颗粒和阳性细胞最稀疏，AO值最低(P＜0.01)。见图2、图3。

3 pERK免疫印迹比较 免疫印迹技术检测发现，各组动物都显示有pERK蛋白的条带。与对照组相比，其他3组NPP动物的pERK蛋白阳性表达均增多。其中，L-NPP组的表达最多，H-NPP组的表达最低。见图4、图5。

图 2 pERK在各组动物脊髓的表达(免疫组织化学)(×400) A： 对照组； B： 正常喂养的NPP组； C： 低锌喂养的NPP组；D： 高锌喂养的NPP组Fig. 2 Immunohistochem istry show ing expression of pERK in spinal cord of control group (A), N-NPP group (B)，L-NPP group (C), and H-NPP group (D) (×400)

图 3 各组小鼠脊髓p ERK表达的平均光密度(n=24， )(a P＜0.01，各组间比较)Fig. 3 Average optical of pERK expression in model m ice spinal cord of each group (n=24，?)(a P＜0.01, vs each other group)

图 4 免疫印迹检测pERK在各组模型动物脊髓的表达Fig. 4 Immune blotting showing expressions of p ERK in spinal cord in different groups

图 5 各组小鼠脊髓pERK表达的免疫印迹图像分析结果(n=24，)(a P＜0.01，各组间比较)Fig. 5 Imm une blotting show ing expressions of p ERK in sp inal cord in different groups (n=24，)(a P＜0.01, vs each other group)

讨 论

胞外信号调节激酶是丝裂原活化蛋白激酶家族的主要成员之一，它能参与多种神经可塑性变化，如长时程增强以及疼痛的产生与维持等[8-9]。近年来，许多痛觉方面的研究结果表明，ERK可被多种生理或病理因素激活，能够介导多种胞内信号的传导，在NPP发生时，其磷酸化(激活)水平增高，与伤害性刺激的传递及神经敏感化有关[10-11]。利用ERK的阻断剂可以有效抑制ERK在脊髓的活化，降低NPP动物的痛觉过敏、痛觉超敏和异位痛等现象，提示ERK激活在NPP的产生与传导过程中发挥了重要的作用[12-13]。本研究结果与之前的研究结果相符，在注射辣椒素后，动物脊髓后角中的pERK表达上调，动物出现痛觉过敏，热痛阈值降低，提示，ERK磷酸化水平上调是神经病理性疼痛的一个重要发病机制，同时也是痛觉过敏的重要标志之一。

锌离子是生命体的关键元素，广泛存在于神经系统中，这些锌离子主要分布在神经元的细胞质以及细胞器的小囊泡内，参与神经传递[14-16]。研究发现，在脊髓后角的神经元中有大量的锌离子以及其运载体—金属硫蛋白-Ⅲ，而脊髓后角是包括痛觉等感觉在内的初级传入神经元的投射部位[5-17]。Jo等[18]研究发现，外周神经受损时，动物脊髓后角浅层的锌离子含量显著降低，动物出现了痛觉过敏现象，机械痛阈显著降低，提示锌离子与痛觉的发生与传导密切相关。在本研究中，我们利用锌预处理模型动物，注射辣椒素后，对动物行为学改变及热痛阈值进行检测，结果发现，注射辣椒素后，动物出现舔足、甩足等痛敏现象，热痛阈值降低。高锌预处理时，缩足等动物行为学改变明显改善，热痛阈值增加。而低锌预处理使动物舔足等行为学改变加重，热痛阈值降低。提示锌能抑制神经病理性疼痛的痛觉过敏。

本结果发现，高锌预处理能降低病理性疼痛模型动物脊髓pERK的表达；而低锌预处理的结果正好相反，增加病理性疼痛模型动物脊髓pERK的表达。提示锌可能是通过抑制pERK在模型动物脊髓后角的表达，从而对神经病理性疼痛产生了抑制作用。

综上所述，我们的实验结果证实了锌可能是通过抑制ERK在脊髓后角的活化，从而降低了中枢的兴奋性和痛觉过敏，因此抑制了病理性疼痛的产生与传递。但是，锌抑制ERK活化的确切机制目前还不十分清楚，需要我们深入地探讨与研究。

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Effect of zinc on the phosphorylative ERK expression in capsaicin induced neuropathic pain in mice spinal cord and hot pain threshold

WANG Yue-jing, LIU Xiao-lu, LI Fu-xing, HAN Yan-xiu, ZHANG Li
Department of Histology and Embryology, Liaoning M edical College, Jinzhou 121001, Liaoning Province, China
Corresponding author: ZHANG Li． Email: ln_zhangli@126．com; LIU X iao-lu． Email: 347863939@qq．com

ObjectiveTo observe the effect of zinc on the expression of phosphorylative extracellularsignal-regulate kinase (pERK) in spinal cord and the hot pain threshold of capsaicin induced neuropathic pain (NPP) in model rats．MethodsSeventy two C57/ BL6 rats w ere randomly divided into 4 groups and capsaicin (0．5%, 5 μl) w as injected in feet of NPP rats to build the model．Control group: normal (zinc, 30 mg/(kg·d)) fed rats injected with solvent (Tween 80, alcohol and 0．9% sodium chloride solution); N-NPP group: normal fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks; L-NPP group: low-zinc (0．85 mg/(kg·d)) fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks; H-NPP group: high-zinc (227mg/(L·d)) fed rats w ere injected with capsaicin after 2 w eeks．Animal ethology observation, immunohistochem istry, immune blotting and image analysis w ere used to test the effect of zinc on the expression of pERK in model m ice spinal cord and the hot pain threshold during seven days after injection．ResultsHigh-zinc feed could down-regulate the pERK expression, im prove the hot pain threshold (P＜0．01), while low-zinc feed can up-regulate the pERK expression, reduce the hot pain threshold (P＜0．01)．ConclusionZinc can inhibit the pERK expression in spinal cord and the hot pain threshold of capsaicin induced NPP in model rats．

zinc; neuropathic pain; spinal cord; phosphorylation; extracellular signal-regulate kinase

R 741.02

A

2095-5227(2014)08-0863-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.08.024

2014-01-23

国家自然科学基金项目(81171799)；辽宁省科技厅资助项目(20111118)；辽宁医学院奥鸿大学生创新基金(2011D17)；辽宁医学院横向课题(LYHX2013025)；辽宁医学院奥鸿博泽研究生科研创新基金(2012009)；辽宁省大学生创新训练计划项目(201210160007) Supported by the National Natural Science Foundation of China(81171799); Science and Technology Committee Foundation of Liaoning Province(2011 1118)

王月静，女，在读硕士。研究方向：锌与神经系统疾病。Email: 335187646@qq.com；共同第一作者：刘晓露，女，本科在读。研究方向：锌与神经系统疾病。Email: 347863939@qq.com

张莉，女，博士，教授。Email: ln_zhangli@126.com