新型杀虫剂甲维盐的快速定性鉴别方法

卢延旭 唐玮玮 许英健 朱晓凯 穆 彪

（中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035）

新型杀虫剂甲维盐的快速定性鉴别方法

卢延旭 唐玮玮 许英健 朱晓凯 穆 彪

（中国刑警学院 辽宁 沈阳 110035）

建立了原药和生物检材中新型杀虫剂甲维盐的系列快速定性鉴别方法，包括理化性状鉴别、显色反应鉴别、紫外鉴别、薄层鉴别和液-质（HPLC-MS）定性鉴别等方法，借助这些快速鉴别方法可与其他类杀虫剂如有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类和新型杀虫剂阿维菌素，以及具有十四元环/十五元环的大环内酯类抗生素药物红霉素、罗红霉素、阿奇霉素等相鉴别。

甲维盐 十六元环 大环内酯结构 定性鉴别

甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin Benzoate，简称甲维盐)，是继有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类和新烟碱类杀虫剂之后的新一代具有十六元环大环内酯结构的抗生素类杀虫剂，现已广泛应用于家庭杀虫、杀螨和农业上水稻、玉米、大豆、高粱、谷物、棉花、果树、蔬菜等的广谱杀虫。近些年来，随着甲维盐等新型农药的推广使用，因喷雾吸入，驱虫使用过量、误服、投毒、自杀等各类中毒事件时有发生。为了协助公、检、法、司系统法医和化验室技术人员做好相关案件的法医学检验和毒物分析工作，本文首次系统建立了原药和生物检材中新型杀虫剂甲维盐的快速定性鉴别方法。

1 实验材料与方法

1.1 实验药品与试剂

甲维盐标准品（Emamectin Benzoate），白色粉末，纯度99.99%；3.2%甲维盐，3.2%阿维菌素，80%敌敌畏，90%灭多威（万灵）；甲醇，色谱纯99.9%；甲醇，分析纯≥99.5%；丙酮，分析纯≥99.5%；其余试剂和药品均为市售分析纯或色谱纯。

1.2 实验设备、仪器与材料

DDL-5型低速冷冻离心机、TGL-16G型高速冷冻离心机；LXQ10208型液相色谱/质谱联用仪。色谱条件：色谱柱 Thermo Gold ODS（150.0mm× 2.1mm，5μm）不锈钢柱，内填DurashellC18；柱温35.0℃；流动相甲醇 5mmol乙酸胺 +0.2%冰乙酸+10%甲醇=80∶20（v／v）；流速0.2 mL/min；进样量10μL。质谱条件：电喷雾离子化源(ESI)，正离子方式检测，全离子扫描模式；扫描范围240.00～900.00amu；毛细管温250℃，毛细管电压42V；源电压5.0kV；鞘气(N2)30arb。MD 100-2型电子天平；DL-CJ-1F实验医用型洁净工作台；FSH-2可调高速分散匀浆机；JKDP型旋涡振荡器；KQ-100DB型数控超声波清洗器；微量移液器；微孔滤膜等。

1.3 实验方法

1.3.1 理化性状鉴别

取4个陶瓷皿，分别用乳胶头滴管加入2%甲维盐、2%阿维菌素、2%敌敌畏和2%万灵4种农药各1ml，肉眼观察颜色、气味和pH值。用乳胶头滴管依次向敌敌畏、万灵、阿维菌素和甲维盐等4种农药原药或染毒小白鼠的胃内容物净化上清液中加入等量的36%盐酸/98%硫酸并震荡后，观察上述4种农药的颜色变化。

1.3.2 显色反应鉴别

将 2%甲维盐原药或含有甲维盐 （＞20μg /mL）的胃内容物净化上清液2mL置于陶瓷皿中，滴加0.1%高锰酸钾2～3滴，观察高锰酸钾溶液的褪色时间。将2%甲维盐溶液（乳白色颗粒原药用甲醇配制而成）或含有甲维盐（＞20μg/mL）的胃内容物净化上清液2mL置于陶瓷皿中，加入0.1%高锰酸钾溶液（粉红色）2～3滴，振摇3～5分钟后液体呈浅土黄色，再加入1%2,4-二硝基苯肼乙醇溶液（橘黄色）2～3滴，振摇3～5分钟，观察甲维盐混合溶液的颜色变化。将含有甲维盐（＞20μg/mL）的胃内容物净化上清液2mL或浓度在20～100μg/mL之间的甲维盐标准品溶液2mL置于陶瓷皿中，加1%亚硝酸钠3～5滴，再滴加浓盐酸2～3滴，充分振摇后，观察甲维盐混合溶液的颜色变化。

1.3.3 紫外鉴别

用紫外分光光度计检测甲维盐和红霉素甲醇溶液在243nm波长处的最大吸收峰。

1.3.4 薄层鉴别

将含有甲维盐（＞20μg/mL）的胃内容物净化上清液或浓度在20～100μg/mL之间的甲维盐溶液，点样于硅胶G薄层板起点线上，采用展开系统A：三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）或展开系统B：乙酸乙酯-正己烷-氨（10:1.5:1.5）展开1h，在紫外灯（UV254nm）下甲维盐显示斑点；喷雾碘蒸气，观察和比较甲维盐标准品和样品的显色情况和Rf值是否一致。

1.3.5 高效液相-质谱色谱法（HPLC-MS）定性

精密称取甲维盐标准品10mg，置于100mL容量瓶中，标记后用甲醇稀释至刻度，配制成100μg/mL母液，再从母液容量瓶中各吸取1mL，分别置于各自的10mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制10μg/mL的甲维盐标准工作液。分别采集甲维盐中毒死家兔的心血lmL，分别用3mL水稀释，涡旋混合1min，8000r／min离心10min，上清液过Oasis® HLB固相萃取柱，(预先以1mL甲醇，1mL水活化)，以1mL50%甲醇水溶液淋洗杂质，弃去，吸取1.0mL甲醇液洗脱测定物，收集洗脱液，过0.2μm微孔滤膜，进样10μL供HPLC／MS检测用。分别采集甲维盐中毒死家兔的心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、胃组织1g，加丙酮∶水（3∶1）至10mL浸泡，经组织匀浆机捣碎，超声20min，8000r/min离心10min，取上清液，在50℃恒温下氮气流挥至2m，8000r/min离心10min，取上清液，过Oasis®HLB固相萃取柱（预先以1mL甲醇，1mL水活化），以1mL 50%甲醇水溶液淋洗杂质，弃去，吸取1.0mL甲醇液洗脱测定物，收集洗脱液，过0.2μm微孔滤膜，进样10μL供HPLC/MS检验用。

2 结果

2.1 甲维盐原药与其他类农药相比较的颜色、气味和PH值

2%甲维盐为淡黄色，有刺鼻的糖醋味，pH值为5；2%敌敌畏为土黄色，有刺鼻的氯醛味，pH值为2；2%万灵为蓝色，有鱼腥味，pH值为8；2%阿维菌素呈绿褐色，有浓烈的糖醋味，pH值为6。

2.2 浓盐酸/浓硫酸水解显色反应

2%甲维盐在浓盐酸/浓硫酸作用下呈白色凝乳状且液面漂浮黄色油珠或形成黄色环状物。而2%敌敌畏、2%万灵和2%阿维菌素在36%盐酸/98%硫酸作用下分别呈现土黄色、黄绿色和咖啡色/土黄色、草绿色和红棕色。

2.3 高锰酸钾反应

甲维盐为十六元环大环内酯类杀虫剂，其分子中含有共轭双键结构，能在30秒以内使高锰酸钾的紫色消褪；而红霉素等大环内酯类药物因分子中没有共轭双键结构，导致高锰酸钾紫色消褪的时间超过30秒。

2.4 高锰酸钾和2,4-二硝基苯肼反应

2%甲维盐甲醇溶液（淡黄色），与高锰酸钾和2,4-二硝基苯肼反应后变成橘黄色带有沉淀物的溶液（1h后变成鲜黄色）。提示甲维盐含有酚羟基，借助此反应可与同类杀虫剂阿维菌素等相鉴别（图1）。

图1 高锰酸钾和2,4-二硝基苯肼反应

2.5 亚硝酸钠-浓盐酸反应

借助此反应主要检测甲维盐分子中的仲胺基，阿维菌素无此反应。仲胺基N上的H，在酸性条件下，可与亚硝基的双键加成变为N-亚硝基胺呈黄色。甲维盐标准品溶液，与亚硝酸钠-浓盐酸反应后，溶液呈鲜黄色（图2）。

图2 亚硝酸钠-浓盐酸反应

2.6 紫外分光光度法鉴别

甲维盐的紫外最大吸收峰为243nm，而红霉素在此处无紫外吸收峰。

2.7 薄层色谱法鉴别

甲维盐为十六元环大环内酯类，薄层展开后仅用紫外灯（254nm）即可显出斑点，而红霉素等大环内酯类药物在紫外灯下（254nm）没有斑点。含有大环内酯类基本母核的化合物遇碘显示棕黄色。甲维盐标准品溶液和含有甲维盐的胃内容物净化上清液样品，在薄层板上遇碘蒸气显示棕黄色斑点。采用三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）展开系统时，样品的Rf值为0.53，与甲维盐标准品的Rf值一致（图3）。

图3 甲维盐的薄层色谱鉴别

2.8 高效液相-质谱联用法（HPLC-MS）定性

在本色谱和质谱条件下，甲维盐的相对保留时间为7.12min。甲维盐的[M+H]+准分子离子m/z886.56为母离子，主要碎片离子：m/z868.32，824.31，302.11，242.40。

3 讨论

本文建立的甲维盐系列定性鉴别方法主要包括理化性状鉴别、4种显色反应鉴别、薄层鉴别和高效液相-质谱联用法（HPLC-MS）定性鉴别方法，填补了甲维盐定性鉴别资料匮乏的空白。

甲维盐属于大环内酯类杀虫剂，加浓盐酸或浓硫酸能使大环内脂类水解呈色，借此能与其他类杀虫剂如有机磷酸酯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类和新烟碱类杀虫剂相鉴别。

根据高锰酸钾褪色时间的长短，可以确定大环内酯类抗生素的母核结构。甲维盐的母核结构为十六元环，有共轭双键结构，能在30秒以内使高锰酸钾褪色；而其他大环内酯类药物如具有十四元环母核的红霉素、罗红霉素、交沙霉素和克拉霉素，以及具有十五元环母核的阿奇霉素，均无共轭双键结构，高锰酸钾褪色时间需要30秒以上。借此能将甲维盐等十六元环大环内酯类杀虫剂与这些药物加以区分。将浸有高锰酸钾的试纸条阴干密封配备于法医现场勘查箱中可以很便捷地进行现场快速筛查。

高锰酸钾和2,4-二硝基苯肼反应，可用于鉴别酚羟基官能团，主要用于检测甲维盐分子中的酚羟基，借助此反应可以与同类杀虫剂阿维菌素及其他不含酚羟基的杀虫剂相鉴别。

亚硝酸钠-浓盐酸反应，主要检测甲维盐分子中的仲胺基。仲胺基N上的H，在酸性条件下，可与亚硝基的双键加成变为N-亚硝基胺呈黄色。阿维菌素无此反应，借此可与大环内酯类杀虫剂中的阿维菌素等同系物加以鉴别。

甲维盐的紫外最大吸收峰为243nm，而红霉素在此波长下无明显的紫外吸收峰。薄层展开后，甲维盐在紫外灯（UV254nm）下显示斑点，而红霉素没有斑点。含有大环内酯类基本母核的化合物遇碘显示棕黄色。在薄层板上点样后，采用三氯甲烷-甲醇-氨水（100:5:1）展开，含有甲维盐和阿维菌素的样品遇碘蒸气均呈现棕黄色斑点，通过与甲维盐和阿维菌素的标准对照品比对Rf值很容易鉴别。

采用液-质联用法，根据在相同色谱和质谱条件下，甲维盐的相对保留时间为7.12min和[M+H]+准分子离子m/z886.56为母离子，主要碎片离子：m/z868.32，824.31，302.11，242.40，可以很快确定样品中或生物检材中的甲维盐成分。

以上定性方法互相补充，专属性和特异性较好，非常适合现场快速检验和实验室确证性鉴别。有关的现场快速筛查试剂盒正在组装和试验之中。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会．中华人民共和国药典2010版二部[M]．北京：化学工业出版社.

[2]王霞，丁晓萍．大环内酯类药物的分析[J]．实用医技杂志，2006，5（12）.

[3]黄彬彬，骆桂红，童小钰等．复凝聚法制备甲氨基阿维菌素苯甲酸盐微囊[J]．农药学学报，2009，11（4）.

（责任编辑：于 萍）

R991

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2013-12-1

公安部应用创新计划项目（编号：2010YYCXXJXY112）。

卢延旭（1958-），男，辽宁沈阳人，中国刑警学院法医学系教授，博士，主要从事法医学研究。