大孔树脂纯化葛根的使用次数和再生方法*

刘慧敏，杜守颖，陆 洋，李鹏跃，冯健男

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

大孔树脂纯化葛根的使用次数和再生方法*

刘慧敏，杜守颖，陆 洋，李鹏跃，冯健男

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

[目的]研究HPD-200A型大孔树脂在纯化葛根素及葛根总黄酮时的使用寿命和再生方法。[方法]以葛根总黄酮和葛根素的吸附容量和精致后的纯度为指标，考察大孔树脂在多次吸附洗脱和再生后的吸附洗脱能力的变化。[结果]树脂初次使用时，葛根素吸附容量约为17.29 g/L，总黄酮的吸附容量约为46.00 g/L，两者的纯度为32.40%和75.52%，连续使用11次后葛根素吸附容量为原来的82.26%，总黄酮的吸附容量为原来的80.99%，两者纯度为27.23%和67.99%，纯度略有降低。用95%乙醇再生处理后，HPD-200A大孔树脂对葛根素和总黄酮的吸附容量分别可达到新树脂的94.35%和91.87%，两者的纯度也均可达到新树脂的97%以上。[结论]使用HPD-200A型大孔树脂精制葛根时，新树脂可连续使用11次，用95%乙醇再生后，至少可连续使用3次，即一批HPD-200A型树脂至少可使用14次,本研究为葛根纯化工艺的产业化确定提供了实验基础和参考。

大孔树脂；葛根；总黄酮；再生

大孔树脂是一种不溶于酸碱及各种有机溶剂，对氧、热、化学试剂稳定且机械强度高的有机高分子聚合物，还具有良好的吸附性能[1]，现已被广泛应用于环境保护、化学工业、临床鉴定、抗菌药物及生化药物的分离纯化等领域[2]，尤其在中国的中药现代化研究中，应用大孔树脂分离富集中药有效成分及中药复方有效部位已越来越受到重视[3-5]。

葛根始载于《神农本草经》，豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根,具有解肌退热、透发麻疹等功效，临床上主要用于外感发热头痛、高血压、颈项强痛、口渴等症[6]。目前，对葛根的分离纯化研究越来越多，其中以大孔树脂纯化效果最佳[7]，因此大孔树脂分离纯化葛根素的研究越来越多[7-11]，且非极性树脂对葛根素和总黄酮显示较好的吸附性能[7]，但涉及树脂使用寿命和再生的研究却较少。HPD-200A型大孔树脂是以苯乙烯为骨架的非极性树脂[12]，实验室前期已考察了HPD-200A大孔树脂纯化葛根的工艺，但每批树脂的预处理花费时间很长，每批处理量小、耗时长而且耗费大量有机溶剂，污染环境，成本高。考虑大生产应省时并节约成本，本实验在已有的葛根纯化工艺基础上，进一步考察了HPD-200A型大孔树脂的使用次数及再生方法，以期为该工艺的大生产提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-20AT液相色谱仪，LC-20AT色谱泵,SPD-20A紫外检测器，LC Solution色谱工作站（日本岛津公司），SP-756（PC）型紫外可见分光光度计（Spectrum shanghai），15 mm×500 mm的玻璃柱，Sartorius BS 110S型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司），CX-100型超声波清洗器（北京医疗设备厂）。

1.2 试药 葛根饮片（北京华邈中药工程技术开发中心，批号：204261），葛根素对照品（中国食品药品检定研究所，批号：110752-00912，供含量测定用），HPD-200A型大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司），冰醋酸（北京化工厂，批号20080708），甲醇为色谱级，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 总黄酮的测定 通过全波长扫描可知，葛根提取物和葛根素溶液均在250 nm波长有最大吸收，故在250 nm波长测吸光度，计算其总黄酮含量。

精密称取葛根素对照品10.40 mg于10 mL容量瓶中，无水乙醇定容。精密量取该溶液2 mL于25 mL容量瓶中，无水乙醇定容。精密量取上述溶液0.1、0.2、0.25、0.5、1、1.5、2 mL于10 mL容量瓶中，无水乙醇定容。以无水乙醇为参比溶液，在250 nm处测定吸光度，以吸光度A与对照品溶液浓度C进行线性回归，得回归方程为A=0.804C+0.020 3，r2= 0.998 8，线形范围为0.832～16.64 μg/mL。

精密度、12 h稳定性、重复性、加样回收率实验RSD值分别为0.43%、0.53%、2.27%、1.99%，符合要求。

2.1.2 葛根素的测定

2.1.2.1 色谱条件 TIANHE Kormasil C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流动相甲醇:1%醋酸溶液（22∶78），流速1.0 mL/min，检测波长250 nm。

梯度洗脱程序：0～20 min，甲醇-1%醋酸溶液（22∶78）；20～25 min，甲醇-1%醋酸溶液（90∶10）；25～40 min，甲醇-1%醋酸溶液（22∶78）。

2.1.2.2 方法学考察 精密称取葛根素对照品适量，用流动相溶解并稀释为 5.32、10.63、21.26、63.78、85.04、106.30 μg/mL的对照品溶液，准确量取各溶液10 μL进样。以样品的峰面积（A）和对照品溶液质量浓度（C），应用最小二乘法线性回归处理后得方程为A=47 259C+2 524.2，r=0.999 9，在质量浓度5.32～106.30 μg/mL，方程的线性良好，符合实验要求。

葛根素乙醇溶液低、中、高浓度（21.26，53.15，85.04 μg/mL）精密度实验的RSD分别为0.11%、0.18%、0.27%，符合要求。

2.2 药液制备 对照品溶液的制备：精密称取葛根素对照品10.40 mg于10 mL容量瓶中，无水乙醇定容。精密量取该溶液2 mL于25 mL容量瓶中，无水乙醇定容，得83.2 μg/mL的葛根素对照品溶液。

自制葛根粗提物:粗提物干燥成干膏，干膏中葛根素和总黄酮含量分别为12.08%和31.42%，取其干膏配成6.75%的水溶液，作为上样液。

2.3 大孔树脂吸附葛根素及总黄酮使用寿命的考察 HPD-200A型大孔树脂用95%乙醇加热回流，至回流液在250 nm处无紫外吸收，再用蒸馏水洗至无醇味。取3份已处理过的树脂13 mL（干质量约2.87 g），分别装入3根内径1.5 cm的树脂柱中，取自制葛根粗提液，上样2 BV（1BV即1倍树脂柱体积），水洗2 BV，30%乙醇洗4 BV。收集每次的上样滴出液、水洗液和醇洗液，分别定容于50、50、100 mL的容量瓶中。最后用适量蒸馏水冲洗树脂至滴出液无醇味，完成1次使用[13]。重复以上操作，计算出每次的吸附容量，共进行13次吸附。

收集的上样滴出液定容后，按含量测定方法测定滴出液中葛根素和总黄酮含量，计算吸附容量。

公式：D=1 000（C1V1-C2V2）/V

D：吸附容量（g/L），C1：上样液中葛根素或总黄酮浓度（μg/mL），V1：上样液中葛根素或总黄酮体积（mL），C2：上样滴出液中葛根素或总黄酮浓度（μg/mL），V2：上样滴出液中葛根素或总黄酮体积（mL），V：树脂体积（mL）。

以吸附次数为横坐标，吸附容量为纵坐标，作图，见图1。

图1 HPD-200A大孔树脂使用次数增加，葛根素和总黄酮的吸附容量变化趋势图(±s,n=3)Fig.1 Adsorption capacity of HPD-200A macroporous resin varies with times to purify puerarin and total flavonoids(±s,n=3)

图1表明：树脂初次使用时，葛根素吸附容量约为17.29 g/L，总黄酮的吸附容量约为46.00 g/L，使用次数增加，树脂吸附能力有所下降，连续使用13次后葛根素吸附容量为原来的80.10%，总黄酮的吸附容量为原来的79.76%。

HPD-200A型大孔树脂由偶极矩很小的单体聚合制得的，不带任何功能基[14]，其作用源于树脂表面的不均匀性和孔填充机制[15]。树脂使用时，吸附质优先占据能量有利的位置。使用次数增加，树脂表面及内部都会残留许多非吸附性成分或杂质，导致树脂表面被覆盖或孔道被部分填充，待测物再次填充难度增大，吸附量下降，考察树脂柱连续使用次数时，当树脂柱吸附容量下降30%以上，则认为该树脂需要再生或停止使用[16-17]，因此HPD-200A树脂用于吸附葛根提取液至少可以使用13次。

收集每次的醇洗滴出液定容于100 mL容量瓶，再取0.25 mL定容于25 mL容量瓶进行含量测定，计算解吸率。以吸附次数为横坐标，解吸率为纵坐标，作图，见图2。同时取出10 mL放入已知质量的蒸发皿中水浴挥干，计算干膏质量及葛根素与总黄酮的纯度，结果见图3。

图2 HPD-200A大孔树脂使用次数增加，葛根素和总黄酮的解吸率变化趋势图(±s,n=3)Fig.2 Desorption capacity of HPD-200A macroporous resin varies with times to purify puerarin and total flavonoids(±s,n=3)

图3 HPD-200A大孔树脂使用次数增加，葛根素和总黄酮的纯度变化趋势图(±s,n=3)Fig.3 The purity of puerarin and total flavonoids varies with the used frequency of HPD-200A macroporous resin (±s,n=3)

图2和图3表明：使用次数增加，葛根素和总黄酮的解吸率都呈缓慢下降而后增加的趋势；而两者的纯度先逐渐降低，使用11次后有明显下降趋势。

随着使用次数的增加，树脂中残留的杂质增加，杂质的表面基团和静电可能吸附待分离物，导致溶剂对其洗脱能力下降，解吸率减小，纯度也相应减小。当杂质积累至一定程度，部分被冲洗出，同时被洗出的待测物也增加，解吸率升高，纯度反而降低。

2.4 大孔树脂再生方法考察 用HPD-200A型大孔树脂纯化葛根，当树脂使用13次后，吸附容量下降了20%左右，葛根素和总黄酮纯度仅为初次使用时的66.01%和69.10%。说明树脂经多次吸附和洗脱后，有一些强吸附性杂质成分保留于树脂床中，降低了树脂对欲分离成分的吸附能力。因此，必须对树脂进行再生处理，除去强吸附成分。

再生情况可视具体情况而定，通常用95%的乙醇洗脱至无色，树脂柱即已再生，然后以大量水洗脱至滴出液无醇味，即可再用。但若树脂受污染严重，颜色变深，吸附能力降低，应酸碱强化再生处理[16]。

95%乙醇洗脱再生工艺考察：对已使用过13次的大孔树脂，先用95%醇浸泡1.5 h，再用95%的乙醇洗脱至滴出液无色，最后用大量水洗脱至无醇味，再重新上样，考察95%乙醇再生后大孔树脂柱的吸附容量、解吸率和对葛根素、总黄酮精制效果，实验结果见表1。

结果表明：用95%乙醇再生后，树脂对葛根素和总黄酮的吸附容量分别可达到新树脂的94.35%和91.87%，纯度也均可达到新树脂的97%以上。且再生后再连续使用3次，对两种指标的吸附容量仍在新树脂的91.70%以上，纯度也都在新树脂的88.90%以上。

3 讨论

大孔吸附树脂能解决其他常用吸附剂难以解决的问题[18]。但使用前对其预处理相对较难，消耗有机溶剂量大，耗时较长，因此考察其使用次数和再生工艺显得尤为重要。

表1 95%乙醇洗脱再生工艺考察(±s,n=3)Tab.1 Regeneration technology of macroporous resins when treated with 95%ethanol(±s,n=3)

表1 95%乙醇洗脱再生工艺考察(±s,n=3)Tab.1 Regeneration technology of macroporous resins when treated with 95%ethanol(±s,n=3)

实验项目 葛根素比吸率（g/L） 总黄酮比吸率（g/L） 葛根素解吸率（%）总黄酮解吸率（%）葛根素纯度（%）总黄酮纯度（%）树脂初次使用 17.29±0.060 46.00±0.21 97.09±0.29 84.81±1.20 32.40±0.08 75.52±0.72连续使用13次 13.85±0.008 36.69±0.03 93.99±1.21 92.00±0.17 21.15±0.12 52.18±0.19再生后初次使用 16.31±0.0005 42.26±0.02 90.69±1.77 83.20±1.41 31.13±0.35 74.00±0.63再生后第2次使用 16.31±0.0004 42.18±0.03 93.91±0.98 88.20±0.36 29.09±0.27 70.61±0.33再生后第3次使用 16.31±0.0002 42.19±0.03 92.39±1.89 88.08±0.72 28.49±0.76 70.27±1.20

本实验通过考察HPD-200A型大孔树脂精制葛根时的使用次数和再生工艺，表明新树脂可连续使用11次，但为控制精制物的纯度，可根据实际需要酌情考虑树脂使用次数并及时再生处理。大多数树脂的再生需要进行酸碱处理[19-21]，此方法需要大量的溶剂，且酸碱的使用存在一定的危险性。本研究采用乙醇常温常压浸泡洗脱法，此法操作简便，再生后树脂的吸附能力和精制效果都基本恢复至新树脂水平，且再生后连续使用3次，树脂的吸附容量和精致效果均无明显变化。因此，HPD-200A型大孔树脂用于精制葛根，新树脂可连续使用11次，再生后至少可连续使用3次，即一批树脂至少可使用14次，既环保又能充分节约成本，本研究可为葛根纯化的工业化生产提供实验基础和参考。

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Life and intensified regeneration technology of macroporous resins in extracting and purifying puerarin and total flavonoids from pueraria lobata

LIU Hui-min,DU Shou-ying,LU Yang,LI Peng-yue,FENG Jian-nan
（School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100102,China）

[Objective]To study the life and intensified regeneration technology of HPD-200A macroporous resins in purifying puerarin and puerarin flavonoids.[Methods]With the adsorption capacity and purity of puerarin and total flavonoids as indexes,the absorption capacity of HPD-200A macroporous resins which were multiple absorbed and intensified regenerated was studied.[Results]First,the adsorption capacity of puerarin and total flavonoids was about 17.29 g/L and 46.00 g/L,respectively.Their adsorption capacity became 82.26%and 80.99%of the original and the purity was 27.23%and 67.99%after HPD-200A macroporous resin was used continuously for 11 times.With 95%glycol regeneration,the adsorption capacity of HPD-200A macroporous resins for puerarin and total flavonoids could reach above 94.35%and 91.87%,the purity was more than 97%of the new resin.[Conclusion]With HPD-200A macroporous resin refining puerarin,new resin can be used for 11 times continuously.When regenerated with 95%ethanol,it can be used at least three times again,that is,the HPD-200A resin can be used at least for 14 times.

macroporous resin;puerarin;total flavonoids;regeneration

R285.5

：A

：1672-1519（2014）03-0177-04

2013-10-21）

（本文编辑：高 杉，马晓辉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.03.16

国家自然科学基金面上项目（81073057）；北京中医药大学复方中药制剂研究创新团队发展计划资助（2011-CXTD-13）。

刘慧敏（1987－），女，在读硕士，主要从事中药新制剂与新技术研究。

杜守颖，E-mail：dushouying@263.net；陆 洋，E-mail：373940890@qq.com。