疏肝健脾方对慢性应激糖尿病大鼠甲状腺功能及组织形态的影响

雷永华 李红 徐蓉娟 范崇信

（1.郑州市第一人民医院，河南郑州 450000；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

疏肝健脾方对慢性应激糖尿病大鼠甲状腺功能及组织形态的影响

雷永华1李红2徐蓉娟2范崇信1

（1.郑州市第一人民医院，河南郑州 450000；2.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032）

目的：观察疏肝健脾方对糖尿病大鼠慢性应激状态下甲状腺功能及组织形态的影响。方法：将75只SD大鼠随机分为正常组15只和造模组60只，造模组60只大鼠诱发糖尿病后再次随机分为模型组、中药组、西药组和中西药结合组，除正常组以外其余各组大鼠在施以慢性不可预知温和刺激以诱发应激状态（4周）同时分别给予蒸馏水、疏肝健脾方、左洛复混悬液、疏肝健脾方＋左洛复混悬液灌胃，正常组亦给予蒸馏水灌胃。治疗12周后测定各组大鼠三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）、游离甲状腺素T3（FT3）、游离甲状腺素T4（FT4）、促甲状腺激素（TSH）水平，并观察甲状腺组织改变。结果：与正常组比较，其余各组大鼠的T3、T4、FT3、FT4均明显降低；中西药结合组大鼠的T3、中药组和中西药结合组的T4均明显高于模型组和西药组。模型组大鼠甲状腺组织有不同程度损伤，各用药组损伤情况介于正常组与模型组之间。结论：疏肝健脾方能对抗链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠应激状态下并发的甲状腺功能减退，可能对糖尿病大鼠应激状态及下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT）有一定的调节作用。

糖尿病 甲状腺 疏肝健脾 中药复方 实验研究

“疏肝健脾方”由上海中医药大学附属龙华医院徐蓉娟教授及其博士生李红主任医师经多年临床实践研制而成，广泛用于临床。该方具疏肝解郁、健脾安神之功效，拓展了应用疏肝健脾法治疗糖尿病及其合并症的临床思路。前期研究表明，疏肝健脾方具有改善糖尿病大鼠甲状腺功能减退的治疗作用[1]，本实验通过观察疏肝健脾方对应激状态下糖尿病大鼠甲状腺功能及病理改变的影响，进一步探讨疏肝健脾方对应激状态下糖尿病大鼠合并甲状腺功能减退的干预作用，并进而探索其相关机制。

1 实验材料

1.1 动物SPF级SD雄性大鼠75只，体重（180±10）g，由上海中医药大学实验动物中心提供。

1.2 造模用药福氏佐剂、链脲佐菌素（STZ）均为美国sigma公司产品。

1.3 治疗用药疏肝健脾方，药物组成：柴胡12g、黄芪30g、茯苓15g、淮小麦30g、石菖蒲15g、丹参15g，由上海中医药大学附属龙华医院制剂室按既定工艺完成并提供。左洛复：由辉瑞制药有限公司提供，50mg/片。

1.4 主要试剂盒及仪器三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）、游离甲状腺素T3（FT3）、游离甲状腺素T4（FT4）、促甲状腺激素（TSH）放射免疫分析药盒等，由北京普尔伟业生物有限公司解放军总医院科技开发中心放免所提供。GC-911r放射免疫计数器，由科大创新股份有限公司中佳分公司生产。

2 实验方法

2.1 糖尿病造模大鼠适应性喂养1周后开始造模。先腹腔注射0.5mL福氏佐剂，次日再按30mg/kg体重腹腔注射STZ溶液（用PH4.2 0.1mL/L无菌枸橼酸钠缓冲液配制）。每周1次，连续3周重复上述步骤。每次注射后均测定血糖和体重。血糖＞16mmol/L为糖尿病模型造模成功。

2.2 糖尿病应激状态模型诱发糖尿病造模成功的大鼠第3天开始给予慢性不可预知温和应激刺激，刺激方式包括制动3h、潮湿笼子17h、倾斜笼子17h、通宵照明、禁食24h、禁水16h加1h空瓶刺激、成组饲养17h，以上刺激安排于1周内，每日1种，连续4周，同种刺激不连续出现。4周后观察大鼠体重、摄食量变化，并行旷场行为测定观察大鼠运动能力、探索行为、侵犯攻击能力、清洁动作次数等情况的变化。

2.3 分组与用药75只SD大鼠先用随机数字表法选取15只作为正常组，剩余60只大鼠诱发糖尿病，造模成功44只，再次随机分为模型组、中药组、西药组、中西药结合组，每组11只。除正常组外其余各组大鼠均施以慢性不可预知温和刺激，同时中药组、西药组、中西药结合组分别给予疏肝健脾方、左洛复混悬液、疏肝健脾方＋左洛复混悬液灌胃，正常组与模型组给予蒸馏水灌胃。疏肝健脾方参照标准动物的等效剂量折算系数法[2]，每只大鼠给予0.1053g/（kg·d）的生药量，相当于成人每日中药用量。左洛复片混悬于CMC溶液中，相当于成人50mg/d用量。各组大鼠均按体重灌胃，每日1次，连续给药12周。整个实验过程中，大鼠有一定的死亡率，且因试剂有限，最终随机选取了部分大鼠进行本研究相关指标的测定。

2.4 甲状腺激素指标测定实验结束后所有大鼠施行麻醉后腹主动脉采血，放入不添加任何抗凝剂的试管中，4℃3000r/min离心15min，分离1mL血清放置-20℃冰箱保存，用于测定T3、T4、FT3、FT4和TSH。测定严格按照试剂盒说明书进行操作。

2.5 甲状腺组织标本测定所有大鼠腹主动脉取血后处死，迅速取出大鼠甲状腺，肉眼观察大体情况，在冰板上去除其周围其他组织，用预冷的生理盐水洗净血液，滤纸拭干，置福尔马林中性固定液（15%）浸泡固定，常规病理组织切片，梯度酒精常规脱水、蜡块包埋后HE（苏木素-伊红）染色，光镜观察组织大体形态，上皮细胞及滤泡病理变化。

2.6 统计学方法实验数据采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料符合正态分布的采用t检验和单因素方差分析，不符合正态分布的采用秩和检验。采用95%CI对统计量的参数进行估计，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 药物对糖尿病应激大鼠甲状腺功能的影响见表1。

表1 各组大鼠药物干预后T3、T4、FT3、FT4、TSH含量比较[±s（平均秩次）]

表1 各组大鼠药物干预后T3、T4、FT3、FT4、TSH含量比较[±s（平均秩次）]

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与西药组比较，△P＜0.05。

组别动物数（只）T3（ng/mL）正常组T4（ng/mL）61.51±0.11（30.50）FT3（ng/dL）FT4（ng/dL）66.74±28.17（28.67）TSH（uIU/mL）3.70±0.75（30.50）9.06±1.43（30.50）10.87±1.45（20.50）模型组7.95±8.03（7.33）**60.33±0.29（6.50）**中药组60.63±0.90（13.33）**1.05±0.55（17.25）**1.63±0.60（10.50）**17.54±13.67（26.00）**8.65±5.05（14.33）中西药结合组90.83±0.12（21.06）**##8.17±0.81（8.67）**##西药组60.48±0.29（11.58）**25.45±2.99（22.50）**#△1.01±0.42（15.67）**2.53±0.90（17.00）**5.78±4.32（6.33）**0.69±0.49（9.83）**2.05±1.29（12.33）**23.45±8.55（19.11）**#△0.92±0.41（13.50）**2.49±1.37（15.44）**10.08±2.75（17.50）

3.2 药物对糖尿病应激大鼠甲状腺组织结构的影响光镜下观察各组大鼠甲状腺组织，发现模型组大鼠甲状腺滤泡上皮细胞厚度较正常组大鼠明显变薄，滤泡内胶体面积增大。各用药大鼠甲状腺组织结构改变情况介于正常组与模型组之间，以中西药结合组大鼠甲状腺组织结构最接近正常组，其次为中药组。西药组与正常组大鼠甲状腺组织结构差异较大，比较接近模型组大鼠甲状腺组织结构特点。见图1。

4 讨论

糖尿病（DM）患者常出现HPT轴功能异常，国外流行病学研究发现DM人群中甲状腺功能异常的发生率明显增高，是非DM患者的2～3倍[3]。2型DM患者合并亚临床甲减会增加DM并发肾病及心血管病变的危险性[4]。Mohn A等[5]发现亚临床甲减会增加青少年Ⅰ型DM患者临床症状性低血糖的危险性，甚至严重者会诱发DM酮症酸中毒。

糖尿病属中医“消渴病”范畴，历代医家早有从肝论治消渴之说，清代医家黄坤载明确提出：“消渴者，足厥阴之病也”，开创了“从肝论治糖尿病”的先河。甲减与消渴中医证型关系密切，结合甲减的临床征象，DM所致甲减与肝脾关系密切，肝郁日久，肝木亢盛，肝旺犯脾，进而致脾失健运，痰湿内生，出现一系列低代谢症候群，治疗应以疏肝健脾为主。根据经络理论，肝经“循喉咙之后”，甲状腺位于足厥阴肝经循行路线上。从神经内分泌调节来看，肝失疏泄常表现为抑郁或烦躁等精神状态的改变，而在这种情绪刺激的应激过程中，甲状腺激素起着重要调节作用。临床观察，肝失疏泄之抑郁与甲状腺功能减低的临床表现相似。近年来从疏肝健脾论治糖尿病合并甲减逐渐引起中医界的关注，但是从肝脾论治糖尿病合并甲减的相关实验为数甚少。本实验所用疏肝健脾方中柴胡舒肝解郁，黄芪补气升阳、益卫固表、敛疮生肌、利水消肿，二者共为君药。淮小麦养心除烦、益肾、除热、止渴，治脏躁、烦热、消渴；石菖蒲辛、温，归心、胃经，开窍、豁痰、理气、活血、散风、去湿，二者共为臣药。丹参活血宁心，茯苓渗湿利水、益脾和胃、宁心安神，共为佐药。全方配伍，共奏疏肝解郁、宁心安神之效，诸药相得益彰。

图1 各组大鼠甲状腺组织病理改变（HE染色，×400）

近年研究发现，应激刺激会影响机体甲状腺激素水平，总体而言，伤害性应激短期使甲状腺激素水平升高，而长期使之下降。甲状腺激素水平下降的机制可能与神经内分泌轴如HPA轴的兴奋有关。有研究显示其机制为脑中蓝斑核对应激做出最初反应后作用于下丘脑室旁核（PVN），刺激其促肾上腺皮质激素释放因子（CRH），CRH使腺垂体分泌ACTH，从而作用于肾上腺皮质，释放糖皮质激素（GC）。GC可抑制TRH和TSH的分泌，阻碍T4向T3转化，这与长期应激常导致的甲状腺激素，尤其是T3的降低密切相关[6]。高氏等[7]观察到，应激组大鼠血清中TT3、TT4、FT3、FT4和TSH的含量均显著低于对照组，说明慢性社会应激（CSS）抑制了HPT轴活动。TH水平对下丘脑、垂体存在反馈调节，形成HPT轴调节通路，CSS有可能影响这一负反馈调节机制。

本实验结果显示，糖尿病大鼠应激状态下存在甲状腺功能减退，中药及中西药合用可升高糖尿病应激大鼠T3、T4水平，降低TSH水平，在一定程度上改善甲状腺功能减退，提示疏肝健脾方对于糖尿病大鼠应激状态下甲状腺激素水平起到一定的调节作用。从TSH水平看，可能有负反馈机制参与其中，但因实验样本量偏少，尚需进一步验证。

综上，糖尿病大鼠在慢性不可预知温和刺激下出现甲状腺功能减退，其原因可能因高血糖状态合并应激状态下HPA轴被激活，体内神经内分泌激素分泌失调，HPT轴也受影响，激素之间相互拮抗，CRH抑制TSH，进而引起甲状腺功能低下。因本实验缺少对HPT轴上游调节指标，如CRH、TRH等的检测，故糖尿病出现甲减的发病机制，尚需进一步实验阐明。本实验表明，疏肝健脾方能在一定程度上调节应激状态下糖尿病大鼠甲状腺激素水平，对改善糖尿病大鼠机体内环境起到一定作用，至于慢性不可预知温和刺激是否加重糖尿病大鼠甲状腺功能减退，尚需进一步实验分析验证。

[1]雷永华，李红，徐蓉娟.疏肝健脾方对糖尿病大鼠甲状腺功能减退的影响.实用医学杂志，2012，28（24）：4053

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R587.105

A

1672-397X（2014）10-0072-03

雷永华（1981-），女，医学博士，主治医师，研究方向：中西医结合治疗内分泌代谢疾病。

徐蓉娟，xrj1118@yahoo.com.cn

2014-05-22

编辑：吴宁

国家自然科学基金项目（30772800）