模拟高住低练对大鼠骨髓源性内皮祖细胞增殖能力的影响

龚晓明 郑澜 瞿树林

1 湖南师范大学体育学院（湖南 长沙410012）

2 四川理工学院体育学院 3 湖南师范大学医学院

低氧训练能提高有氧运动能力， 主要是通过促进红细胞生成、血管新生等作用实现的[1，2]，但其机制复杂，一直是国内外研究的热点之一。 前期研究已证实，低氧训练后，心肌组织呈现丰富套叠式血管新生的形态学特征[3]，由于成熟的血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）分裂，增殖能力有限，因此我们推测是具有分化为血管ECs 功能的某些干细胞， 如内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）参与了作用。研究发现，对大鼠进行不同方式低氧训练后，高住低练组心肌血管壁上AC133（又称CD133）蛋白表达最多[4]，AC133 是早期EPCs 的特异性表面标记物，晚期EPCs和ECs 不表达[5]。 早期EPCs 主要存在于外周血中[6]，笔者提取大鼠外周血单个核细胞进行体外培养诱导分化发现，高住低练组的EPCs 增殖最为明显[7]，但机制不清楚。 由于EPCs 来自于骨髓，能在外周血中循环，可在某些生理、病理状态下以骨髓释放入血或自身复制的方式，黏附于血管内皮，不断增殖、分化，形成单层内皮结构，参与微血管再生[6，8，9]。因此，本研究旨在探讨低氧与运动复合刺激对骨髓源性EPCs 的影响，且这一结果与外周血EPCs 的增殖是否有因果关系， 为低氧训练促进心肌微血管新生的机理研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

健康雄性2 月龄Sprague-Dawley 大鼠24 只，分为常氧居住组（不训练，常氧居住）、低氧居住组（不训练，低氧居住）、常氧训练组（常氧训练，常氧居住）和高住低练组（常氧训练，低氧居住）。 每组6 只，每只体重约200 g，由湖南农业大学提供，生产许可证号：湘scxk2009-0006。 用国家标准啮齿类动物饲料饲养，生活期间室温保持20℃～23℃，相对湿度45%～55%，每日光照12 h，低氧居住组每天低氧居住12 h（湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室）。常氧训练组采用杭州立泰科技有限公司动物实验跑台进行递增负荷跑台训练，每周训练6 天，共持续8 周，跑台坡度10%（表1）。

表1 大鼠训练方案（速度×持续时间）

1.2 低氧处理

采用美国Hypoxico 公司的低氧装置，用美国产TOXIRAE PGM-36 型氧气监测仪实时监测低氧舱中氧含量的变化。 根据所需高度对应的氧浓度调整氧气监测仪，低氧程度逐周递增（表2）。

表2 低氧处理方案

1.3 取材

训练方案结束后12 h， 用0.4%水合氯醛l ml/100 g 体重麻醉后，于70%的酒精中浸泡1 min（除头部），将大鼠呈仰卧位固定于超净工作台内，暴露胸腔，用注射器自心尖快速抽血至无血液抽出，剪开两后肢皮毛， 取股骨和胫骨放入盛有PBS 液的培养皿中，在培养皿中用镊子、手术剪和手术刀除去骨骼上的肌肉筋膜，用5 ml 注射器吸PBS 液反复冲洗骨髓腔收集骨髓。

1.4 EPCs 分离培养及诱导分化

将骨髓腔冲洗液以1∶1 比例加入含有大鼠淋巴细胞分离液 （中国生物工程有限公司） 的离心管，22℃下2000 rpm 离心20 min， 用吸管收集中间白膜层的单个核细胞（Mononuclear cells，MNCs）。0.01 mol/L PBS 液洗涤2 次，依次以2000 rpm 及1500 rpm 室温离 心10 min。 用EGM-2 完 全 培 养 基（Clonetics，Lonza，美国）调整细胞密度至3×106/cm2，一部分等量接种于铺有明胶的培养瓶， 一部分接种于铺有明胶的24 孔培养板，置于5 %CO2、饱和湿度、37℃培养箱中培养48 h 后更换培养液， 去除未贴壁细胞，之后每3 天换液一次，应用相差倒置显微镜（Olympus，日本）连续观察体外培养EPCs 的形态及增殖情况。

1.5 EPCs 的双荧光染色鉴定

采用前期报道的方法进行EPCs 的双荧光染色鉴定[7]。

1.6 EPCs 增殖能力检测

贴壁细胞计数：细胞培养48 h 后换液，每个样本随机取5 个视野， 倒置显微镜下计数贴壁细胞数目（×100），绘制柱状图。

EPCs 生长曲线绘制： 向接种有细胞的24 孔培养板内加入EGM-2 培养基0.5 ml/孔， 置于培养箱中，培养基每3 d 更换1 次，生长曲线根据培养2、4、6、8、10、12 和14 d，各取3 孔细胞数之和计数绘制。

EPCs 增殖平均速率计算：根据上述各阶段细胞计数结果计算2～14 d 内每2 天的增殖百分比，再计算其平均值， 则为细胞增殖的平均速率， 绘制柱状图。

1.7 统计学分析

所得数据用SPSS17.0 统计软件处理。 每组样本测得数据均进行正态分布检验 （one-Sample Kolmogorov-Smirnov Test）。 服从正态分布的数据（P ＞0.1）以平均值±标准差（±s）表示，组间两两比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齐性用LSD 检验，方差不齐用Tamhane’s T2 检验，显著性差异水平α=0.05，P ＜0.05 为显著性差异，P ＜0.01为高度显著性差异； 不服从正态分布的数据根据数据特点进行数据变换， 变换后数据服从正态分布按正态分布数据进行统计分析（方法同前），变换后仍不服从正态分布的则采用中位数±四分位数表示，组间比较采用多样本秩和检验（K-Related Samples），显著性差异水平α=0.05，P ＜0.05 为显著性差异，P ＜0.01 为高度显著性差异。

2 结果

2.1 形态学观察结果

骨髓分离后获得的单个核细胞于100 ml 培养瓶中培养48 h 后半量换液， 见大部分细胞已贴壁，并有少量贴壁的梭形细胞， 表明细胞开始进入贴壁生长阶段（图1a）。 第5 d～7 d 开始，贴壁细胞形成大小不一的多个细胞克隆，即集落生成单位（Colonyforming unit，CFU）出现（图1b 箭头所示），表明此时细胞的增殖开始活跃。 第10 d 细胞集落明显增多，彼此相连并聚集于培养瓶中间区域生长（图1c）。 第12 d 观察细胞集落、贴壁梭形细胞形态及密度与第10 d 大致相似，表明此阶段细胞增殖缓慢，进入平台期。 第20d 开始分化为内皮细胞， 出现管腔样结构（图1d 圈出区域）。

2.2 双荧光染色鉴定结果

荧光显微镜下见Dil-ac-LDL 染色细胞发红色荧光，FITC-UEA-1 发绿色荧光，两者双染阳性为正在分化的EPCs，呈黄色荧光（图2）。

2.3 EPCs 增殖能力检测结果

培养48 h 换液后，低氧居住组、常氧训练组和高住低练组贴壁细胞数量与常氧居住组相比均显著增加（P ＜0.05，P ＜0.01）；高住低练组贴壁细胞数量比低氧居住组、常氧训练组显著增加（P ＜0.01），表明低氧与运动复合刺激比单纯的低氧或运动刺激更能促进EPCs 的增殖。而低氧居住组和常氧训练组之间无显著性差异（P ＞0.05），说明低氧或运动单独刺激对EPCs 增殖的影响作用无差别（图3）。 细胞生长曲线显示，体外培养的各组细胞在14 d 内都随时间延长而增殖（P ＜0.01）。 第14 d 的细胞计数结果显示，低氧居住组、常氧训练组和高住低练组贴壁细胞数量均多于常氧居住组（P ＜0.05），其中高住低练组贴壁细胞数量最多， 而低氧居住组和常氧训练组无差异（P ＞0.05）（图4）。 各组细胞的增殖平均速率差异无统计学意义（P ＞0.05）（图5）。

图1 倒置显微镜下细胞形态（×100）

图2 EPCs 的荧光染色鉴定

图3 各组贴壁细胞数目（±s，n=6）

图4 细胞生长曲线（±s，n=6）

图5 细胞增殖平均速率（±s，n=6）

3 讨论

机体EPCs 有两种类型[6]，早期EPCs 来自外周血单个核细胞，呈梭形，培养到2～3 周时达到生长高峰，第4 周时逐渐死亡消失；晚期EPCs 主要来源于骨髓单个核细胞， 少量存在于外周血中， 呈鹅卵石形，在培养的第2～4 周，细胞集落出现在早期EPCs中间，在4～8 周呈指数生长，于第12 周逐渐死亡消失。

本实验证实了运动可以使健康大鼠骨髓源性EPCs 增殖能力增强，数量增多，这与Steiner 等[9]的研究结果有相似之处；且低氧可以诱导EPCs 增殖并向ECs 分化，从而促进血管生成[10，11]，这与本研究发现的低氧促进EPCs 的增殖相吻合；而采用运动和低氧的复合刺激较单纯运动或低氧条件下EPCs 的增殖更明显， 一方面证明了高住低练模型建立的科学性， 另一方面为高住低练促进血管新生的机制提供了部分证据。这一结论与前期发现的外周血EPCs 增殖情况类似，如果外周血中增殖的EPCs 仅仅是早期EPCs，那么骨髓中的EPCs 增殖又有何意义？ 骨髓中的EPCs 主要是晚期EPCs， 这种EPCs 只少量存在于外周血中，易在人脐静脉内形成单层ECs[6，12，13]，因此，它的主要功能应当是修复内皮，虽不直接参与血管再生，但具有促进和协助作用。 此外，某些干细胞在一定条件下可诱导分化为其他干细胞[14]，但目前尚无证据证明早期和晚期EPCs 能相互转化，所以前期研究中发现的外周血EPCs 是否部分或全部来源于骨髓，仍需进一步研究证实。

各组细胞14 d 内的增殖平均速率没有差异，可能存在以下几个原因：（1） 各组细胞从培养48 h～14 d 的增殖平均速率没有差异，但在第48 h 时，细胞数量已经出现了差异，这说明不同处理因素对EPCs 增殖有影响；（2）韩佐生等[15]发现高原训练后下高原参赛只有把握最佳时间才能发挥最好水平， 间隔时间过短机体易不适应， 过长则导致高原效应消失，因此，本研究中的EPCs 增殖平均速率有可能受到了运动或低氧的影响，但这种“效应”或“痕迹”在撤销运动或低氧刺激后的14 d 内已经消失，提示高住低练与比赛的时间间隔应合理安排，以免错过因EPCs 增殖而产生一系列机体效应的最佳时期；（3）各组细胞体外培养的环境相同，但在体内不同，各组大鼠的神经和激素调节情况、VEGF 含量等影响EPCs 生长的因素[16]，可能因为处理方式不同存在差异[17]，因此，在本研究中，体外培养的EPCs 增殖平均速率是否代表活体内EPCs 的增殖速度，尚需更深入的实验研究。

感谢中南大学湘雅医学院中心实验室祝和成教授、吴尚辉老师，湖南师范大学生命科学院吴秀山教授，湖南师范大学医学院杨华中、任翔老师在实验中给予的指导和支持！

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