江苏地区汉族人群冠心病患者肝X受体基因-6A多态性

朱锦，孙建辉，白江涛，罗光华

（常州市第一人民医院心内科，江苏常州213003）

江苏地区汉族人群冠心病患者肝X受体基因-6A多态性

朱锦，孙建辉，白江涛，罗光华

（常州市第一人民医院心内科，江苏常州213003）

目的：探讨江苏地区冠心病患者肝X受体（liver X receptor，LXR）基因-6A（rs11039155）多态性位点与冠心病遗传易感性的关系。方法：选取江苏地区冠心病患者165例，健康体检者191例作为对照。采用单荧光标记探针技术检测LXR-6A基因型。同时测定两组样本三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖等生化指标。结果：LXR-6A（rs11039155）仅检出一种基因型，与探针完全匹配，出现一个融解峰，Tm值55．21℃。随机抽取22例样本进行测序，提示基因型为GG纯合子。结论：江苏地区汉族人群不存在LXR-6A（rs11039155）单核苷酸多态性位点。

肝X受体；基因；冠心病；多态性；汉族

冠心病（coronary heart disease，CHD）是一类多因素疾病，遗传因素及环境影响决定了疾病的发生及发展过程。现代观念认为，血管内皮细胞损伤、血小板反应、脂质浸润、动脉平滑肌细胞增殖和结缔组织合成增加为主要病理过程。冠心病的危险因素包括高血压、脂质代谢异常、糖尿病和糖耐量异常、吸烟等。其中血胆固醇升高，尤其是血LDL-C升高为独立危险因素。

肝X受体α（liver X receptorα，LXRα）是一类核受体家族成员，主要分布于肝脏、脂肪组织、肾、脾、小肠和巨噬细胞，由定位于11号染色体短臂（11p11．2）的基因编码［1］。内生性配体为氧化甾醇和胆固醇生物合成途径的中间产物。肝X受体必须与视黄醇X受体结合形成异二聚体作用于靶基因，从而发挥生物学效应，主要生理功能为控制胆固醇内环境稳定，脂蛋白代谢及脂肪合成［2］。研究发现，肝X受体信号通路在动脉粥样硬化发展中起重要作用。在小鼠模型中，合成的肝X受体激动剂可抑制动脉粥样硬化的发展，其效应可能是源于对相关代谢和炎症基因表达的调控［3］。

肝X受体α在胆固醇代谢及动脉粥样硬化过程中的重要作用提示其与冠心病可能存在一定关联。而目前国内外尚没有关于该基因多态性与冠心病相关性的研究。本课题通过病例与健康者的对照研究，从分子遗传学角度探讨LXRα基因位点-6A多态性在江苏地区汉族人群中分布情况及在冠心病发病过程中的可能作用。

1 对象与方法

1．1 对象

冠心病组165例为2005年8月至2008年6月本院心内科住院的冠心病患者，男133例，女32例，平均年龄（61．96±9．93）岁。全部冠心病病例均依据1979年WHO颁布的缺血性心肌病诊断标准，以冠状动脉造影各主要分支存在≥50%狭窄定义为有意义病变。部分患者已接受他汀类药物降血脂治疗。对照组191例为健康体检者，男150例，女41例，平均年龄（60．90±9．48）岁。经询问病史、体格检查、实验室常规生化检查、心电图检查等初步排除冠心病、高血压、糖尿病。选取病例均为无近亲血缘关系的江苏地区汉族人。

1．2 方法

1．2．1 观察指标 一般情况、既往疾病史、疾病家族史、吸烟饮酒史，晨起测体质量、身高、血压。空腹12 h取静脉血2 mL，生化分析仪检测三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、空腹血糖等生化指标。

1．2．2 外周血白细胞DNA的制备 取EDTA抗凝静脉血100μL，用UIIQ-10柱式血液基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，TE缓冲液溶解保存于－20℃冰箱中。

1．2．3 主要仪器与试剂 Roche公司LightCycler（版本号3．5）基因扩增检测仪，Taq DNA聚合酶，4×dNTPs，10×缓冲液以及MgCl2等。LXR-6A的引物序列上游：5′-GGCTTACTCCAATAATCCCCACACTT-3′，下游：5′-AAGGAAGAAGGCAGGTAATGATGAAGGAG-3′。

1．2．4 LXRα基因-6A位点基因型检测 采用聚合酶链式反应（PCR），并根据碱基淬灭探针技术设计单荧光探针检测单核苷酸多态性［4］。PCR反应在Roche公司LightCycler基因扩增检测仪上进行。随机抽取10%的样本进行2次基因型分析。

1．3 方法学比较

随机选取PCR扩增后样本送上海申友公司进行测序，并比对测序结果。

1．4 统计学分析

应用SPSS 13．0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差±s）表示。两组均数比较采用t检验。直接计数法计算冠心病组及对照组基因型和等位基因频率分布。用Kappa检验对碱基淬灭探针技术与DNA测序计数的检验结果进行一致性检验。

2 结果

2．1 两组一般临床资料比较

对照组与冠心病组之间年龄、男女构成比、空腹血糖之间差异无统计学意义（P＞0．05）。对照组总胆固醇、HDL-C、LDL-C明显高于冠心病组（P＜0．05），而冠心病组三酰甘油明显高于对照组。见表1。

2．2 基因分型

LXR-6A（rs11039155）选自美国国家生物技术情报中心dbSNP数据库（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/sites/entrez），位于5′UTR。可产生3种基因型，分别为GG、AA和GA。本实验特异性扩增出长度447 bp的LXRα基因片段。扩增产物通过特异性的单荧光探针进行检测。冠心病组165例中仅检出GG基因型，对照组191例也仅检出GG纯合子。两组合计356例，均未检出AA纯合子及GA杂合子。与探针完全匹配，仅一个Tm值55．21℃，出现一个融解峰（图1）。

2．3 LXR-6A测序结果

随机选取22例样本进行测序，其中，冠心病组9例，对照组13例，结果提示该位点基因型均为GG型。测序结果如图2。

2．4 方法学比较

碱基淬灭探针技术与DNA测序结果比较，一致性Kappa检验显示2种单核苷酸多态性检验结果一致（Kappa＝1，P＝0．000）。见表2。

3 讨论

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率大于1%，是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上［5］。SNPs数量大，分布广，在不同人群中的分布频率也有差异，这些差异可以代表某一种族或人群的遗传差异。本研究中，LXR-6A（rs11039155）位点在中国汉族人群356例样本中，仅见一种基因型，即GG纯合子，未见AA纯合子及GA杂合子，A的等位基因频率远小于1%，提示江苏地区汉族人群中不存在该SNPs位点。美国国家生物技术情报中心（NCBI）的dbSNP数据库中未见LXR-6A（rs11039155）位点的种族分布报道。Legry等［6］报道，法国人群2 290例样本中，GG纯合子1 799例，GA杂合子461例，AA纯合子30例，构成比分别为78．56%，20．13%，1．31%，G、A等位基因频率分别为88．62%，11．38%。对于现有已公开的SNPs数据库分析研究后，我们发现，欧洲人的样本中包含了80%的SNPs，而非洲裔美国人样本则仅有50%的SNPs［7］。这些结果提示SNPs存在人种分布的差异性，本研究也验证了这一可能结果。研究者将频率较高的基因型称为祖先型［8］。本研究中位点G为祖先型。从人类起源及基因变异的角度看，A的产生可能是人类在进化过程中的基因漂移及自然选择的结果，法国人群中的这一位点由G突变成A并进化形成SNPs，而江苏地区汉族人群LXR-6A（rs11039155）并没有形成SNPs。

LXR信号通路参与机体的脂质代谢，肝X受体激动剂还可通过抑制活性氧生成和AMP活化的蛋白激酶激活缓解高血糖诱导的内皮祖细胞功能障碍［9］。而脂质代谢紊乱、血管内皮功能障碍均是冠心病的发病机制之一。Legry等［6］研究还发现，LXR-6A位点可降低30%患代谢综合征的危险（校正OR＝0．68，95%CI：0．53～0．86，P＝0．001），同时LXR-6A与升高血HDL-C水平相关（P＝0．02）。现在认为代谢综合征为冠心病的等危症。HELENA研究发现LXR及其靶基因ABCA1、apoE、CEPT、LPL基因多态性与青少年时期血清HDL-C浓度存在关联［10］。弗明汉心脏研究（Framingham Heart Study）发现血HDL-C水平每升高1 mg／dL，可降低女性心血管疾病发病率3%，降低男性心血管疾病发病率2%［11］。一项日本人群流行病学研究发现，血HDLC水平较低，可显著独立增加缺血性脑卒中的发病率。携带LXR-6A对于冠心病、代谢综合征及缺血性脑卒中等具有协同保护作用［12］。而中国汉族人群缺乏LXR-6A，从而可能缺乏这一保护因素。

本研究结果表明在汉族人群中不存在LXR-6A（rs11039155）这一SNPs位点，为进一步理解冠心病及代谢综合征发生发展的分子生物学机制及防治提供了新的线索。同时也为人类基因组多样性计划（Human Genome Diversity Project）dbSNP提供了相关位点新的人种分布信息。但是本研究选取样本量为356例，且多为江苏地区人群，样本量偏小，人群范围较局限，还有待于大规模、多中心的大样本研究进一步确证。

［1］ Willy PJ，Umesono K，Ong ES，et al．LXR，a nuclear receptor that defines a distinct retinoid response pathway［J］．Genes Dev，1995，9（9）：1033－1045．

［2］ Wojcicka G，Jamroz-Wisniewska A，Horoszewicz K，et al．Liver X receptors（LXRs）．PartⅠ：structure， function，regulation of activity，and role in lipid metabolism［J］．Postepy Hig Med Dosw（Online），2007，61：736－759．

［3］ Joseph SB，McKilligin E，Pei L，et al．Synthetic LXR ligand inhibits the developmentofatherosclerosis inmice［J］．Proc Natl Acad Sci U SA，2002，99（11）：7604－7609．

［4］ Luo G，Zheng L，Zhang X，et al．Genotyping of single nucleotide polymorphisms using base-quenched probe：a method does not invariably depend on the deoxyguanosine nucleotide［J］．Anal Biochem，2009，386（2）：161－166．

［5］ Collins FS，Brooks LD，Chakravarti A．A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation［J］．Genome Res，1998，8（12）：1229－1231．

［6］ Legry V，Cottel D，Ferrieres J，et al．Association between liver X receptorαgene polymorphisms and risk of metabolic syndrome in French populations［J］．Int J Obes（Lond），2008，32（3）：421－428．

［7］ Carlson CS，Eberle MA，Rieder MJ，et al．Additional SNPs and linkage-disequilibrium analyses are necessary forwhole-genome association studies in humans［J］．Nat Genet，2003，33（4）：518－521．

［8］ Bamshad MJ，Wooding S，Watkins WS，et al．Human population genetic structure and inference of group membership［J］．Am J Hum Genet，2003，72（3）：578－589．

［9］ Li X，Song Y，Han Y，et al．Liver X receptor agonist alleviated high glucose-induced endothelial progenitor cell dysfunction via inhibition of reactive oxygen species and activation of AMP-activated protein kinase［J］．Microcirculation，2012，19（6）：547－553．

［10］ Legry V，Bokor S，Beghin L，et al．Associations between common genetic polymorphisms in the liver X receptorαand its target genes with the serum HDL-cholesterol concentration in adolescents of the HELENA Study［J］．Atherosclerosis，2011，216（1）：166－169．

［11］ Asztalos BF，Cupples LA，Demissie S，et al．High-density lipoprotein subpopulation profile and coronary heart disease prevalence in male participants of the Framingham Offspring Study［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（11）：2181－2187．

［12］ Soyama Y，Miura K，Morikawa Y，et al．High-density lipoprotein cholesteroland risk of stroke in Japanesemen and women：the Oyabe Study［J］．Stroke，2003，34（4）：863－868．

Liver X receptorαgene polymorphism s（-6A）of the patients w ith coronary heart disease in Han population in Jiangsu province

ZHU Jin，SUN Jian-hui，BAIJiang-tao，LUO Guang-hua
（Department of Cardiology，the First People′s Hospital of Changzhou，Changzhou Jiangsu 213003，China）

Objective：To investigate the relation between-115A（rs12221497）and-6A（rs11039155）pointmutation of liver X receptorαand the patientswith coronary heart disease（CHD）．M ethods：The-6A polymorphism in the liver X receptorαgenewere detected by using single-labeled probe technique．Plasma cholesterol，triglyceride，HDL-cholesterol，LDL-cholesterol，fasting blood glucose（FBG）were determined in 165 patients with CHD and 191 normal controls．Results：LXR-6A（rs11039155）had only one genetype．Randomly selected 22 cases of samples for gene sequencing，suggesting：genetypes of GG homozygote．Conclusion：There was nomutation in liver X receptorαgene-6A point in Han population in Jiangsu province．

liver X receptor；gene；coronary heart disease；polymorphism；the Han nationality

R543．3

A

1671－7783（2014）05－0412－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140145

朱锦（1980—），男，江苏高邮人，主治医师，硕士，主要从事冠心病的基础与临床研究；孙建辉（通讯作者），教授，硕士生导师，E-mail：sunjianh＠sohu．com

2014－05－28 ［编辑］何承志