干扰EV71病毒2Apro基因的siRNA具有潜在的抗病毒作用

刘海冰，孔枕枕，赵培培，茅凌翔，苏兆亮，陈建国

（1．江苏大学附属人民医院检验科，江苏镇江212002；2．江苏大学医学院，江苏镇江212013；3．镇江市疾病预防控制中心，江苏镇江212004）

干扰EV71病毒2Apro基因的siRNA具有潜在的抗病毒作用

刘海冰1，孔枕枕2，赵培培2，茅凌翔3，苏兆亮2，陈建国1

（1．江苏大学附属人民医院检验科，江苏镇江212002；2．江苏大学医学院，江苏镇江212013；3．镇江市疾病预防控制中心，江苏镇江212004）

目的：探讨以肠病毒71（entrovirus 71，EV71）2A蛋白酶（2A）基因为靶序列合成的siRNA是否具有潜在的抗病毒作用。方法：用Lipofectamine 2000脂质体分别将40、60、80 nmol／L FITC标记的BLOCK-iT Fluorescent Oligo转染RD细胞，通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率。将化学合成的3个siRNA-2Apro（siRNA-69、294、319）和阴性对照的乱序si-RNA（siRNA-SCS）转染RD细胞，siRNA-2Apro为实验组，siRNA-SCS为阴性对照组，另设模拟转染组，仅用脂质体处理；用EV71分别感染各组RD细胞，观察细胞形态学改变，荧光定量PCR和蛋白质印迹检测病毒RNA和VP1蛋白。结果：当siRNA浓度为60 nmol／L时转染效率最高，达87%。细胞形态学结果显示，与对照组比较，实验组细胞只发生了轻微的病变。荧光定量PCR和蛋白质印迹结果显示，siRNA-2Apro组的病毒RNA和VP1蛋白明显低于对照组（P＜0．01）。结论：以EV71 2Apro基因为靶序列化学合成的siRNA能有效地抑制病毒的复制。

肠病毒71；RNA干扰；siRNA；2Apro基因；病毒抑制

肠道病毒71（enterovirus 71，EV71）属于小RNA 病毒科肠道病毒A组，是手足口病的主要病原体之一［1］，感染多发生于5岁以下儿童，重症感染患儿常出现神经系统相关并发症，甚至死亡［2］。迄今为止，尚缺乏特异、高效的抗病毒药物治疗EV71引发的感染［3］，因此，寻找一种潜在有效的治疗方案显得十分必要。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术已成为抑制多种病毒复制的有效方法，为治疗EV71引起的手足口病提供了重要手段。EV71 2A蛋白酶（2Apro）基因序列具有高度保守的特性，且与病毒的致病性直接相关，故推测以该序列为靶点的siRNA可能具有潜在的抗病毒作用。本实验以2Apro基因为靶标，体外验证siRNA-2Apro是否具有抑制EV71病毒复制的能力。

1 材料与方法

1．1 细胞培养与病毒株

RD细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养，置37℃，5%CO2培养箱中孵育。EV71病毒株由镇江市疾病预防控制中心馈赠。

1．2 siRNA的设计与合成

以EV71的2Apro基因序列（JN001860．1）为靶的3个siRNA由Invitrogen公司设计并合成，作为阴性对照的乱序siRNA（siRNA-SCS）与其中一个siRNA序列组成相同，但与靶基因没有明显的同源性。FITC标记的BLOCK-iT Fluorescent Oligo作为绿色荧光对照，检测转染效率。合成的siRNA用去RNA酶水溶解成20 nmol／L后于－20℃保存备用。

1．3 siRNA转染和EV71感染

主要步骤：a．转染前1 d，将RD细胞种植于24孔细胞培养板中，每孔400μL细胞悬液，密度为5 ×104细胞／孔，用不含抗生素的培养基于37℃，5% CO2孵育过夜。用预热的无血清培养基400μL替换每孔中旧培养基，另培养24 h，转染时细胞密度达50%左右，每个实验组设3个平行孔。b．将60 nmol／L siRNA溶于50μL无血清培养基中，稀释混匀，室温静置5 min。c．将2μL Lipofectamine 2000溶于50μL无血清培养基中，稀释混匀，室温静置5 min。d．将b和c步骤中所得混合液混匀，室温静置20 min，加入24孔板中，于37℃，5%CO2细胞培养箱中培养。e．6 h后弃培养基，加入含2%胎牛血清的DMEM，置于细胞培养箱中继续培养。f．转染24 h后用感染复数（MOI）为0．01的EV71感染细胞。

1．4 转染效率检测

FITC标记的BLOCK-iT Fluorescent Oligo用于检测siRNA的最适转染效率。按上述转染步骤将不同浓度（40，60，80 nmol／L）的BLOCK-iT Fluorescent Oligo与2μL Lipofectamine 2000混合物转染RD细胞，24 h后于倒置荧光显微镜下检测其转染效率。随后胰酶消化细胞，移至EP管中，离心，PBS洗3次，转移至流式管中，用流式细胞仪检测转染效率。

1．5 细胞病变效应

实验分为6组，分别为siRNA-69组，siRNA-294组，siRNA-319组，siRNA-SCS组，模拟转染组（仅用Lipofectamine 2000处理），病毒处理组。按上述转染步骤分别对各组转染60 nmol／L相对应的siRNA，24 h后用0．01 MOI的EV71感染，48 h后于倒置显微镜下观察各组RD细胞形态学改变。

1．6 荧光定量PCR检测病毒RNA

用于荧光定量PCR的引物由上海生工设计合成，扩增片段为EV71 2A基因序列（136～318 bp），用该片段作标准品，获取标准曲线。引物序列：上游，5′-ACTGCCCAAGGTTGTGAC-3′，下游，5′-TTCTGAGTGACCCTGTGC-3′。按“1．3”步骤转染siRNA，然后用EV71感染，24 h后用Easy Pure Viral DNA／RNA Kit（Transgen Biotech）严格按照说明书提取病毒RNA。取8μL总RNA，按照Easy Script Firststrand cDNA Synthesis Super Mix（Transgen Biotech）说明书严格操作，获得20μL cDNA溶液。取8μL cDNA模板，按照Thermo Scientific DyNAmo Color-Flash SYBR Green qPCR Kit（Thermo Scientific）操作行荧光定量PCR，通过标准曲线计算病毒RNA的量。

1．7 蛋白质印迹检测病毒蛋白

各组RD细胞感染病毒36 h后，用RIPA裂解缓冲液裂解细胞并收集病毒VP1蛋白。等量蛋白行SDS-PAGE电泳分离蛋白，然后电转移至PVDF膜，5%BSA封闭1 h，抗VP1抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再加入酶标记二抗，室温孵育1 h。TBST洗膜后加显色剂ECL-plus曝光，观察结果。

1．8 统计学分析

数据用均数±标准差表示，采用SPSS 11．5软件进行统计学分析，多组间均数比较采用单因素方差分析，组间进一步两两比较采用LSD-t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 siRNA序列

以EV71的2Apro基因序列为靶点设计合成3个 siRNA，分别为siRNA-69、siRNA-294和siRNA-319。通过BLAST比对，结果显示，3个siRNA对靶基因高度特异且与人类基因无同源性。相关siRNA信息如表1所示。

2．2 转染效率

如图1所示，当BLOCK-iT Fluorescent Oligo浓度为60 nmol／L时，转染效率最高，达87%；40 nmol／L时由于浓度偏低，细胞荧光强度较暗；80 nmol／L时，转染效率反而降低。因此，选择60 nmol／L siRNA作为最适转染浓度进行RNA干扰实验。

2．3 siRNA抑制EV71引起的细胞形态学改变

如图2所示，siRNA-SCS组、模拟转染组和病毒组的RD细胞出现浓缩、变圆、核皱缩等形态学改变，而siRNA-69、siRNA-294和siRNA-319组的RD细胞仅出现了轻微的细胞病变。结果表明，3个siRNA具有抑制EV71的能力，可保护由病毒引起的RD细胞病理改变。

2．4 siRNA抑制EV71的RNA和蛋白表达

荧光定量PCR结果表明，与对照组比较，siRNA-69、294和319处理组的病毒RNA量明显降低，且siRNA-69组抑制能力最强，siRNA-294组相对较弱，siRNA-319组抑制效果最差（图3）。VP1蛋白是EV71衣壳蛋白之一，检测其表达可验证病毒RNA量降低是否会导致病毒蛋白相应下调。结果表明，与对照组比较，各siRNA处理组VP1蛋白表达量明显降低，且各siRNA的抑制能力与荧光定量PCR结果相一致。见图4。

3 讨论

RNAi是由高度保守的双链小干扰RNA介导的转录后同源mRNA特异性降解的基因沉默现象［4］。其中，siRNA作用靶点的选择是该技术成功治疗疾病的关键，既要有高度保守的特性，又要其编码的蛋白质具有重要的生理功能。EV71基因组为只含有一个开放阅读框的单股正链RNA，约7 400 bp，可编码含2 194个氨基酸的多聚蛋白；后者在自身水解产生的蛋白酶切割作用下产生P1、P2和P3三个前体蛋白，随后再经一系列加工，P1前体蛋白形成VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白，最终构成病毒的外壳。P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白：2A、2B、2C、3A、VPg、3C和3D［5］。研究表明，靶向EV71基因组VP1、3′UTR、2C、3C和3D区域的siRNA能够有效抑制EV71感染，但大多数靶点序列在中国EV71流行株基因组中并不保守［6－9］，因此，不具有抗EV71中国流行株的广谱效能。为此，有必要重新选择靶基因保守区域设计siRNA。

2Apro具有半胱氨酸蛋白酶活性，在病毒的复制和致病过程中起重要作用。EV71感染宿主细胞后，能诱导细胞内真核生物翻译起始因子4GI（eIF4GI）和DNA修复酶PARP发生裂解，从而阻止宿主细胞的转录和翻译，加强病毒本身的转录和翻译［10］。此外，EV71的2Apro还具有抑制干扰素的作用，从而逃脱宿主细胞的免疫清除［11］，促进自身物质的大量合成，产生大量子代病毒，当积累到一定数量时，通过启动细胞的凋亡信号导致宿主细胞死亡，加快病毒的进一步传播。由于2Apro基因序列具有高度保守性，因此，推测以该序列为靶点的siRNAs可能具有潜在的抗EV71效能。

本研究针对EV71 2Apro基因序列设计合成3个siRNA，结果表明均具有抑制EV71复制的能力，且能有效保护感染EV71细胞的活力，抑制效果为siRNA-69＞siRNA-294＞siRNA-319。上述抗病毒能力的差异，可能是由于各siRNA的热力学稳定性不同，导致形成RNA诱导的沉默复合体的能力也有所不同；其次，RNA连接蛋白可能引起siRNA对靶位点的结合能力下降；也可能由于靶序列不同的二级或三级结构引起的空间阻力不同，导致与siRNA结合的难易程度也不同［12］。

根据体外实验结果，本研究初步证实siRNA-2Apro具有高效的抑制病毒复制的能力，然而，该siRNA在体内是否具有相同的抗病毒能力还有待进一步研究。另外，要有效地将该siRNA应用于体内治疗，仍面临着许多障碍，比如血液或组织中核酸酶的降解、肾脏的快速清除以及引起的组织毒性或免疫反应等［13－14］。尤其重要的是少数EV71感染患儿可引发严重的神经系统并发症，如何将siRNA通过血脑脊液屏障到达神经细胞发挥干扰作用仍是一个有待解决的问题。

［1］ Zhang D，Lu J，Lu J．Enterovirus71 vaccine：close but still far［J］．Int J Infec Dis，2010，14（9）：e739－e743．

［2］ Zhou H，Guo SZ，Zhu YF，et al．Clinical characteristics of hand，foot and mouth disease in Harbin and the prediction of severe cases［J］．Chin Med J（Engl），2012，125（7）：1261－1265．

［3］ Wu KX，Ng MM，Chu JJ．Developments towards antiviral therapies against enterovirus71［J］．Drug Discov Today，2010，15（23／24）：1041－1051．

［4］ Ramachandran PV，Ignacimuthu S．RNA interference—a silent but an efficient therapeutic tool［J］．Appl Biochem Biotechnol，2013，169（6）：1774－1789．

［5］ Wong SS，Yip CC，Lau SK，et al．Human enterovirus 71 and hand，foot and mouth disease［J］．Epidemiol Infect，2010，138（8）：1071－1089．

［6］ Yang Z，Li G，Zhang Y，et al．A novelminicircle vector based system for inhibiting the replication and gene expression of Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16［J］．Antiviral Res，2012，96（2）：234－244．

［7］ Wu Z，Yang F，Zhao R，et al．Identification of small interfering RNAs which inhibit the replication of several enterovirus 71 strains in China［J］．J Virol Methods，2009，159（2）：233－238．

［8］ Tan EL，Tan TM，Tak Kwong Chow V，etal．Inhibition of enterovirus 71 in virus-infectedmice by RNA interference［J］．Mol Ther，2007，15（11）：1931－1938．

［9］ Lu WW，Hsu YY，Yang JY，et al．Selective inhibition of enterovirus 71 replication by short hairpin RNAs［J］．Biochem Biophys Res Commun，2004，325（2）：494－499．

［10］ Kuo RL，Kung SH，Hsu YY，et al．Infection with enterovirus 71 or expression of its 2A protease induces apoptotic cell death［J］．JGen Virol，2002，83（Pt 6）：1367－1376．

［11］ Wang B，Xi X，Lei X，et al．Enterovirus 71 protease 2Aprotargets MAVS to inhibit anti-viral typeⅠinterferon responses［J］．PLoS Pathog，2013，9（3）：e1003231．

［12］ Ui-Tei K，Naito Y，Takahashi F，et al．Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference［J］．Nucleic Acids Res，2004，32（3）：936－948．

［13］ Guo P，Coban O，Snead NM，et al．Engineering RNA for targeted siRNA delivery andmedical application［J］．Adv Drug Deliv Rev，2010，62（6）：650－666．

［14］ Juliano R，Alam MR，Dixit V，et al．Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides［J］．Nucleic Acids Res，2008，36（12）：4158－4171．

siRNA against the 2Aprogenom ic region of EV71 exerts potential antiviral effects

LIU Hai-bing1，KONG Zhen-zhen2，ZHAO Pei-pei2，MAO Ling-xiang3，SU Zhao-liang2，CHEN Jian-guo1
（1．Department of Clinical Laboratory，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2．School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；3．Zhenjiang Center for Disease Control and Prevention，Zhenjiang Jiangsu 212004，China）

Objective：To explore whether siRNA targeted the 2A protease genomic（2Apro）region of enterovirus 71（EV71）possesses potential antiviral effects．M ethods：RD cells were transfected with 40，60 and 80 nmol／L BLOCK-iT Fluorescent Oligo labeled with FITC，transfection efficiency of siRNA was detected by flow cytometry and fluorescencemicroscopy．RD cellswere transfected with three siRNA-2Apro（siRNA-69，294，319），the experimental group，and siRNA-SCS，the negative group；the MOCK group only dealed with Lipofectamine 2000．Morphological changes of RD cells in each group were observed under the microscopy，viral RNA and protein were tested by quantitative RT-PCR and western blotting，respectively．Results：Themaximal transfection efficiency occurred when the siRNA concentration was at60 nmol／L，the transfection efficiency was up to 87%．RD cells of siRNA-2Aprogroup showed slight cytopathic effect and a higher cell survival rate compared to control groups，through the observation of themorphological changes of the cells infected with EV71．The results of quantitative RT-PCR and western blotting revealed that the levels of viral RNA and protein of siRNA-2Aprogroup were significantly lower than the control group（P＜0．01）．Conclusion：siRNAs targeted the 2Aprogenomic region of EV71 exerts potential antiviral effects．

enterovirus 71；RNA interference；siRNA；2Aprogene；viral inhibition

R373．2；R393

A

1671－7783（2014）05－0403－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140090pro

国家自然科学基金资助项目（81370084）；镇江市社会发展项目（SH2012036）

刘海冰（1987—），男，硕士研究生；陈建国（通讯作者），主任技师，E-mail：cjg02＠126．com

2014－04－07 ［编辑］刘星星