磁珠富集法构建播娘蒿SSR文库及特性分析

王亚平，焦振彬，裴宋雨，叶永忠，王红卫

(1.河南农业大学生命科学学院，河南 郑州450002;2.河南农业大学植物保护学院，河南郑州450002)

播娘蒿 (Descuminia sophia(L.)Webb.ex Prantl)为十字花科播娘蒿属1年生或2年生植物，俗名米米蒿，分布于北美洲、亚洲、欧洲及南美洲，在中国主要分布于华北、华东、西北和四川.其种子具有止咳平喘、消肿利尿、抗癌的功效［1］，在调血脂、抗菌等方面也具有显著的药理活性［2］.以播娘蒿种子为原料榨出的油可以作为食用油，含有约37%的α-亚麻酸，对人体的健康有重要作用［3］;亦可作为工业用油，以播娘蒿籽油为原料制备出的脂肪酸甲酯，经冷冻处理后表现出和生物柴油相近的性质［4］.播娘蒿种子含油 33% ～44%［5］，无论是作为工业用油还是食用油，都具有较大的开发利用价值.因此系统开发和利用播娘蒿资源，能够很好的平衡人类对油料的需求.近年来，对播娘蒿的研究多集中在化学成分与生物学特性的分析上［6～9］，关于播娘蒿遗传资源的研究鲜有报道.研究播娘蒿的遗传多样性，对今后播娘蒿野生资源的开发和利用十分必要.分子标记是研究植物资源的有效手段，其中SSR标记具有共显性、重复性强、多态性高、多态位点丰富等优点［10］，它比其它分子标记如RFLP，RAPD，AFLP和ISSR虽然成本高，但能较好的运用于植物分类、群体遗传多样性研究和基因图谱的构建.传统的SSR文库构建策略不仅复杂，而且效率低，利用磁珠富集法构建SSR文库具有操作简单、效率高等优点.它的原理是用含有生物素标记的探针如(CA)10与基因组DNA酶切片段含SSR片段特异性杂交，而磁珠外边所包被的链霉素亲和素可以和探针上的生物素共价结合，通过磁珠的磁力直接将探针连同与之互补的含有SSR片段吸附［11］.这种方法能显著缩短构建SSR文库的时间，并且极大的提高了效率.本研究即是利用Dynal磁珠富集法构建播娘蒿SSR文库，研究播娘蒿的遗传资源，为播娘蒿的资源研究和开发利用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

播娘蒿材料是2012-04-18采自郑州北郊的黄河湿地国家级自然保护区，沿直线每隔50 m取样1次(共20份)，采集的叶片加硅胶密封包装，干燥处理1周后用于提取DNA.干燥处理过程中，如发现硅胶变红，立即更换硅胶.

1.2 方法

1.2.1 酶切 本研究采用Dynal磁珠富集法构建播娘蒿SSR文库.首先采用改良的CTAB法［12］提取播娘蒿基因组DNA，纯化后利用内切酶Rsa I于16℃温度下酶切16 h.

1.2.2 连接 获得的酶切产物经琼脂糖凝胶检测后加上接头SuperSNX 24-F(5’-GTTTAAGGCCTAGCTAGCAGAATC)和 SuperSNX24-R(5’-pGATTCTGCAGCTAGGCCTTAAAC AAAA).对加接头产物进行 PCR扩增，反应体系25 μL，为10×PCR 缓冲液 2.5 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 1.3 μL，2 mmol·L-1dNTP 1.875 μL，双蒸水 18.3 μL，5 U·μL-1exTaq 0.2 μL，加接头的 DNA 2 μL.PCR程序为95℃预变性2 min，随后为95℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸90 s的24次循环，最后15℃保持10 min.PCR反应后进行琼脂糖凝胶检测，检测成功后进行富集工作.

1.2.3 富集 利用含有生物素标记的(AC)8，(AG)8和(ATG)12(由上海生工合成)探针与连接产物充分杂交，杂交后利用Dynal磁珠对杂交产物进行富集.采用PCR对富集DNA片段进行扩增，反应体系为 25 μL，10 × PCR 缓冲液 2.5 μL，1 000 mg·μL BSA 0.625 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 1.3 μL，2 mmol·L-1dNTP 1.875 μL，双蒸水 16.5 μL，5 U·μL-1exTaq 0.2 μL，富集 DNA 片段 2 μL.PCR程序为95℃预变性2 min，随后为95℃变性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸90 s的24次循环，72℃充分延伸30 min后于15℃保持10 min.PCR反应后进行琼脂糖凝胶检测.

1.2.4 克隆及克隆筛选 将富集产物连接到pMD18-T上，转入DH 5α感受态细胞，在LB培养基上进行克隆培养，挑选阳性克隆转入液体LB培养基进行培养.利用SuperSNX 24-F引物对菌液克隆进行PCR检测，反应体系10 μL，包括2×PCR Taq Mix 5 μL，双蒸水 4 μL，10 μmol·L-1SuperSNX24-F 0.5 μL，菌液 0.5 μL.反应程序为94℃预变性10 min，随后进入30次循环，包括94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后终延伸10 min，15℃保持10 min.选择插入片段长度为400～1 000 bp的克隆.

随后，采用 M13F，M13R 和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探针相结合的方法对文库进行2次PCR扩增筛选，PCR 体系10.5 μL，包括2 ×PCR Taq Mix 5 μL ，双蒸水 3 μL，10 μmol·L-1M13R(F)0.5 μL，10 μmol·L-1(AC)80.5μL，10 μmol·L-1(AG)80.5 μL，10 μmol·L-1(ATG)50.5 μL.反应程序为94℃充分变性10 min，随后进入30次循环，包括94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，最后终延伸10 min，15℃保持10 min.对扩增出条带的克隆送样测序(此工作由华大基因完成).

1.3 数据处理

WEBER将SSR分为3种类型［13］，完全型为核心序列以不间断的重复方式构成SSR;不完全型是核心序列之间有几个非重复碱基，但其两端的核心序列重复次数大于3;混合型为2种或2种以上的串联核心序列由几个连续的非重复碱基分隔开，但各种连续性的核心序列重复次数不少于5.测序后，统计SSR情况，柳属植物研究中，表现出多态性的二核苷酸基元重复次数在4次以上［14］，本研究统计二核苷酸基元重复次数在4次以上的;三核苷酸及其以上基元统计重复次数在3次以上［15］，计算完全型SSR，不完全型SSR以及混合型SSR各自所占的比例，以及平均单个克隆含有的SSR位点数等.

2 结果与分析

2.1 酶切结果

对纯化后的播娘蒿总基因组DNA利用内切酶Rsa I进行酶切，酶切产物集中在300～1 000 bp(图1)，符合后续试验对DNA片段长度的要求.

图1 播娘蒿基因组DNA Rsa I酶切产物Fig.1 The result of enzyme digestion of Descuminia sophia genomic DNA with RsaⅠ

2.2 连接结果

以SuperSNX24-F作为引物对连接产物进行PCR扩增，取2 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测(图2).连接结果很成功，可以直接用于下一步富集.

2.3 富集

生物素标记的探针与加接头的DNA片段杂交，磁珠吸附后对富集片段进行PCR扩增，为增加富集产物浓度，做3管PCR，富集结果如图3，富集片段集中于500～800 bp，适用于构建SSR文库.

图2 连接产物检测结果Fig.2 PCR products of ligated DNA

图3 富集产物PCR结果Fig.3 PCR products of microsatellite-enriched DNA

2.4 克隆筛选

将3管PCR合并纯化，与PMD18-T载体连接后转入感受态细胞在LB培养基上培养，共挑选774个阳性克隆至液体LB培养基，培养后进行菌液PCR扩增检测，检测结果如图4.为避免盲目测序，对有条带的菌液用 M13R(F)通用引物和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探针相结合进行 2 次筛选，选取含有理想条带的克隆进行测序.

2.5 播娘蒿SSR统计

筛选获得93条插入片段为400～1 000 bp的克隆测序.经测序，82条序列含有SSR位点，占测序总条数的88.17%.共有SSR位点数127个，完全型SSR位点数目102个，不完全型SSR位点数目10个，混合型SSR位点15个.SSR重复单元(表1)中，以二核苷酸(TC/CT)，(AC/CA)，(TG/GT)和三核苷酸(TGA/GAT/ATG)最为常见，得率分别为 20.47%，26.77%，21.26%和 15.75%.

图4 菌液PCR检测结果Fig.4 PCR amplification of clones

表1 播娘蒿微卫星富集文库基元类型及比例Table 1 Characteristics of the enriched library of Descuminia sophia in terms of the identified microsatellite sequences

本研究采用磁珠富集法构建播娘蒿SSR文库，该方法中探针与不含SSR位点的片段存在一定程度的结合，为减少测序的盲目性，使用M13R载体通用引物和(AC)8，(AG)8，(ATG)5探针相结合进行2次筛选，共测序93条，含有SSR位点的序列就有82条，占测序总条数的88.17%.

播娘蒿SSR文库中出现了16种重复基元，以二核苷酸 AC/CA，TG/GT，TC/CT和三核苷酸TGA/GAT/ATG出现次数最多，分别为34，27，26和20次，占 SSR位点总数的20.47%，26.77%，21.26%和15.75%，其它重复基元出现次数较少.本研究使用的生物素探针为(AC)8，(AG)8和(ATG)12，研究结果中SSR基元多以与这些探针互补配对为主.如果增加更多类型的探针，估计会得到更多类型的SSR基元.文库中，二核苷酸基元最多重复35次，三核苷酸单元最多重复26次，四核苷酸基元最多重复4次，六核苷酸基元最多重复4次.

播娘蒿SSR位点中，重复次数在4～35次(表2)，重复次数在4～10次的有80个，占SSR位点总数的62.99%;重复次数在11～20次的有31个，占SSR位点总数的24.41%;重复次数在20次以上的有16个，占SSR位点总数的12.60%.

表2 SSR重复次数分布Table 2 SSR repetition number distribution

播娘蒿SSR位点中，重复长度在8～95 bp(表3)，重复长度在8～20 bp的有65个，占SSR位点数的51.18%;重复长度在20～40 bp的有40个，占SSR位点数的31.50%;重复长度大于40 bp的有22个，占SSR位点数的17.32%.

表3 SSR重复长度分布Table 3 SSR repeatitiion length distribution

3 讨论

播娘蒿SSR重复基元以二核苷酸重复基元最多，占SSR位点总数的69%.在莲属植物的研究中，设计的11对SSR引物全部来自于二核苷酸重复的基因序列［16］;谷子的研究中，分析多态性的22对引物中有20对引物的SSR为二核苷酸重复［17］;用于分析银杏遗传多样性的11对引物其SSR全部为二核苷酸重复［18］.这说明用二核苷酸重复基元的DNA片段设计引物，较容易检测多态性.本研究获得的播娘蒿SSR文库中，二核苷酸重复的位点占69.68%，满足开发SSR标记的需要.

杜仲20个能检测到多态性的SSR分子标记中，其二核苷酸SSR重复次数在9～16次，三核苷酸SSR重复次数在7～12次［19］;兰属植物遗传多样性研究中，表现出多态性的14对SSR引物中，二核苷酸SSR重复次数在9～32次，三核苷酸SSR重复次数在4～12次［20］;中国红枣的研究中，表现出多态性的25对SSR引物，全部为二核苷酸基元重复，重复次数在6～15次［21］.而播娘蒿的二核苷酸基元重复次数分布在4～35之间，三核苷酸基元重复次数分布在4～26，大部分克隆含有潜在多态SSR位点，可进行下一步开发 SSR位点引物的工作.

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