宫颈液基薄层脱落细胞联合HPV及p16检测在宫颈癌早期筛查中的临床意义

2014-04-13陆晓青陈洁瑛舒青青朱晓萍刘素贞

浙江医学 2014年13期

陆晓青陈洁瑛舒青青朱晓萍刘素贞

陆晓青陈洁瑛舒青青朱晓萍刘素贞

目的探讨薄层液基脱落细胞检查（TCT）、高危型乳头状瘤病毒（HPV）DNA检测及脱落细胞p16蛋白免疫细胞化学检测在宫颈癌早期筛查中的应用价值。方法对TCT、HC2-HPV-DNA检测至少一项异常的815例患者，利用剩余细胞学标本进行p16免疫组化检测，同时行阴道镜及病理组织学检查进行对照。结果HC2-HPV-DNA的阳性率和宫颈脱落细胞中p16表达阳性率随着宫颈病变严重程度的增加而明显升高（P＜0．01）。HC2-HPV-DNA+TCT检测提高了宫颈癌及癌前病变的检出率，p16免疫细胞化学检查则提高了检测的特异度。结论在TCT和HC2-HPV-DNA检测的基础上，联合应用脱落细胞p16免疫细胞化学染色，可提高宫颈癌早期筛查的准确性。

薄层液基脱落细胞检查人乳头状瘤病毒 p16 宫颈肿瘤宫颈上皮内瘤变

宫颈癌的发病有逐年上升的趋势，我国宫颈癌发病及死亡人数占全世界的1/3。宫颈癌的发生和发展是一个多因素、多步骤的长期过程，是多因素共同作用的结果。因此，早发现、早诊断对宫颈癌的防治具有重要意义。脱落细胞学检查，特别是近年来推广的液基薄层脱落细胞检查（TCT），在宫颈癌的筛查中发挥了巨大作用。但是，即使每年接受细胞学检查，仍然有约10%的妇女发展成浸润性宫颈癌。高危型人乳头状瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌发生的始动因子，因此，高危型HPV DNA检测，如二代杂交捕获法（HC2-HPV-DNA），在宫颈癌筛查中也有重要作用。p16蛋白异常表达和HPV感染与宫颈上皮内瘤变（CIN）及宫颈癌均有密切的关系[1]，并且随着病变的加重而呈动态变化，它们在宫颈癌筛查中的应用价值开始受到重视。本研究将TCT、HC2-HPV-DNA和p16蛋白免疫组化染色检测联合应用，并以组织学检查结果为标准进行对照，探讨三者联合应用在宫颈癌早期筛查中的临床意义。

1 对象和方法

1.1 对象本院门诊2012-01—2013-06共对7 161例患者进行TCT、HC2-HPV-DNA联合检测，其中至少一项检查异常者815例。815例患者年龄18～68岁，平均（35.4±6.5）岁；均为已婚或未婚有性生活史3年以上；全部行阴道镜检查及病理学活检，剩余细胞学标本重新制片，进行p16免疫组化染色。

1.2 方法

1.2.1 TCT 采用宁波美生公司的TCT检测仪，按操作说明进行制片。由两位有经验的医生按TBS分类法（2001年）标准诊断，报告结果包括：正常范围（NILM）、意义不明的非典型鳞状细胞（ASC-US）、低度鳞状上皮内瘤变（LSIL）、高度鳞状上皮内瘤变（HSIL）、鳞状细胞癌（SCC）。ASC-US及以上定义为TCT检查阳性，剩余标本均保存于-20℃冰箱。

1.2.2 HC2-HPV-DNA检测采用美国Digene公司提供的第二代杂交捕获技术，LV/CO值≥1.0判定为高危HPV DNA阳性。

1.2.3 宫颈脱落细胞中p16免疫组化检测剩余细胞学标本制成薄片，95%乙醇固定30min、蒸馏水漂洗，抗原热修复后，免疫组化SP法检测p16蛋白。鼠抗人单克隆抗体p16和SP试剂盒等均购自福州迈新生物技术有限公司。实验操作严格按照试剂盒说明书进行。结果判断：p16表达定位于细胞核和（或）细胞质，黄色或棕色染色为阳性，按阳性细胞所占比例及分布情况分级。阴性（-）：单个细胞染色，阳性细胞数＜5%；弱阳性（+）：散在或小的细胞团染色，阳性细胞数5%～24%；阳性（++）：片状或簇状细胞染色，阳性细胞数25%～50%；强阳性（+++）：弥散的细胞着色，阳性细胞数＞50%。

1.2.4 阴道镜检查与宫颈活检由阴道镜专职医师进行操作，对可疑病灶进行镜下定位活检，若镜下未发现明显病灶或图像不满意，则取宫颈多点组织活检，所有组织病理学检查均由两位有经验的病理医生作出诊断。

1.3 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件，计数资料的统计和分析采用χ2检验，并计算高危型HPV检测、p16免疫组化诊断宫颈病变的敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值等。

2 结果

2.1 TCT与病理组织学检查结果的符合情况见表1。

由表1可见，TCT与病理组织学诊断的一致性较好（χ2=1104.86，P＜0.01）。

2.2 HC2-HPV-DNA检测与病理组织学检查结果的符合情况见表2。

由表2可见，HPV-DNA阳性率随着宫颈病变程度的增加而明显增高（χ2=160.36，P＜0.01）。

表1 TCT与病理组织学检查结果的符合情况[例（%）]

表2 HC2-HPV-DNA检测与病理组织学检查结果的符合情况[例（%）]

2.3 不同TCT诊断患者p16蛋白的表达情况见表3。

表3 不同TCT诊断患者p16蛋白的表达情况

由表3可见，随着TCT诊断级别的增高，p16蛋白阳性率呈明显增加的趋势。

2.4 不同病理组织学诊断患者p16蛋白表达情况见表4。

表4 不同组织病理学诊断患者p16蛋白的表达情况

根据组织学诊断结果，将患者进一步分成≤CINI和≥CINII两组，宫颈脱落细胞p16蛋白表达阳性率分别为41.72%（262/628）和97.86%（183/187），差异有统计学（χ2=183.215，P＜0.01）。

2.5 3种方法诊断宫颈病变效能的比较以病理组织学诊断作为金标准，TCT、HC2-HPV-DNA及CT+HC2-HPV-DNA检测对于病理组织学诊断≥CINI患者的诊断效能见表5。

表5 TCT、HC2-HPV-DNA单独与联合检测效能的比较（%）

由表5可见，TCT与HC2-HPV-DNA联合检测能提高检测的灵敏度和特异度。进一步分析显示，TCT、HC2-HPV-DNA和p16联合检测对CINI及以上病变的灵敏度为100%，特异度为91.46%（407/445），三者联合应用特异度较高（χ2=119.247，P＜0.01）。

3 讨论

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤，其病死率高居女性癌症的第2位。宫颈癌的发生要经过一个较长的癌前病变阶段，在这个阶段通过规范的防癌筛查，尽早发现、诊断并治疗宫颈病变就可以阻断其发展为宫颈癌[2-3]。目前临床上常用的筛查方法有：TCT、HC2-HPV-DNA检测等。细胞学检查在宫颈癌早期筛查中发挥了巨大的作用，但据统计包括TCT在内的细胞学检查技术只能发现约51%的宫颈癌前病变及宫颈癌，细胞学与病理组织学的对比研究提示两者诊断符合率大致在70%～80%[4]。进一步提高宫颈癌早期筛查技术的敏感度和特异度已经成为当前宫颈癌防治技术亟待克服的难题。现代分子生物学研究表明高危型HPV DNA检测可能作为宫颈癌前病变的最敏感的筛查方法[5-7]。但是，由于只有高危型HPV的持续性感染才能导致宫颈癌及其前期病变的发生，而多数可能呈现的是高危型HPV的一过性感染，这些患者与宫颈癌的发生关系并不密切。因此，HPV DNA检测作为单独筛查方法存在特异性过低的缺点，尚不能应用于初筛工作。

p16基因又称多瘤抑制因子（MTS1）基因或CDKN2基因，是NK4家族的重要成员，编码产物是p16蛋白。p16基因的缺失与突变在许多肿瘤的发生、发展中起重要作用。Gupa等[8]和Muluany等[9]发现在宫颈各种病变中，p16表达的阳性率随病变程度增加而升高，表达强度也由弱到强，提示p16检测可作为诊断宫颈癌前病变及宫颈癌的指标。本研究结果显示，宫颈脱落细胞中p16表达的阳性率也随着宫颈细胞学级别的升高而增加，与组织学宫颈病变程度密切相关，与国外Negri等[10]的研究结果一致。

本研究通过TCT、HC2-HPV-DNA和脱落细胞p16免疫组化检测与病理组织学检查对比发现，如果仅用TCT检测宫颈病变时，有一部分患者可能存在过度诊断的问题；而如果仅使用HC2-HPV-DNA检测、筛查宫颈病变，将漏诊相当一部分低度病变，两者结合可提高诊断宫颈病变的敏感度，降低漏诊率；但在提高宫颈病变检出率的同时，却降低了诊断的特异度，有可能导致过度诊断与治疗。联合p16免疫组化检测，则大大提高了检测结果的特异度，尤其对诊断CINII及以上病变的敏感度、特异度更高。在临床工作中，CINI通常只需要随访，而CINII及以上病变则需要积极治疗。因此，脱落细胞学p16检测对于指导临床治疗显得更有价值。综上所述，在TCT或HC2-HPV-DNA检测结果阳性的基础上，结合p16蛋白免疫组化染色，将在一定程度上提高宫颈癌及癌前病变筛查的灵敏度和准确性，有较高的临床应用价值和推广前景。

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Thin cytology test and HPV DNA detection combined with p16 immunocytochemistry in screening of early cervical cancer

Objective To evaluate the application of thin cytology test(TCT)and Hybrid Capture 2-high risk HPV-DNA test (HC2-HPV-DNA)combined with p16 immunocytochemical staining in screening of early cervical cancer．MethodsTotal 815 women underwent TCT and HC2-HPV-DNA testing,the specimens with at least one abnormal finding were subject to p16 immunocytochemical examination,and biopsy under colposcopy was also performed for these patients．ResultsThe positive rate of both HC2-HPV-DNA test and p16 expression increased with the degree of cervical lesions(P＜0．01)．Simultaneous detection of TCT and HC2-HPV-DNA increased the detection rate of cervical cancers and cancer precursor lesions．Incorporation of these two tests with p16 Immunocytochemical staining improved the specificity of detection．ConclusionTCT and HC2-HPV-DNA detection combined with immunocytochemical staining for p16 can improve the specificity of cervical cancer screening．

TCT Human papillary virus p16 Cervical tumorCervical intraepithelial neoplasm