ALOX5基因启动子SP-1结合位点多态性与儿童哮喘的相关性研究

刘占利 陈岳明 盛文彬 黄先玫 杨一华 冯亚男 黄晖 郑绪阳

ALOX5基因启动子SP-1结合位点多态性与儿童哮喘的相关性研究

刘占利 陈岳明 盛文彬 黄先玫 杨一华 冯亚男 黄晖 郑绪阳

目的 探讨ALOX5基因启动子SP-1结合位点多态性和汉族儿童支气管哮喘发生的关联。 方法 选取88例支气管哮喘儿童为病例组，124例健康儿童为对照组。用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）分析ALOX5基因启动子SP-1结合位点多态性，采用实时荧光逆转PCR检测病例组和对照组ALOX5各基因型儿童外周血ALOX5 mRNA表达量。 结果 临床资料显示有家族史、非母乳喂养、有过敏史和被动吸烟与儿童支气管哮喘发病相关（P＜0．05），性别、年龄差异无统计学意义（P＞0．05）。经PCR-SSCP鉴定ALOX5有6种基因型，包括4/4、4/5、4/6、5/5、5/6和6/6；ALOX5基因多态性在汉族儿童中分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0．361，P＞0．05）。等位基因4及基因型（4/4+4/5）在病例组和对照组中分布差异均有统计学意义（均P＜0．05）。健康儿童ALOX5 mRNA表达量（0．20±0．14）显著低于哮喘儿童（0．28±0．15）（P＜0．05）；基因型（4/4+4/5）个体ALOX5 mRNA表达量高于基因型（5/5+5/6）个体（P＜0．05），其余各基因型组间差异均无统计学意义（均P＞0．05）。 结论 ALOX5基因启动子SP-1结合位点多态性可能与汉族儿童支气管哮喘相关，该位点调控ALOX5 mRNA表达。

支气管哮喘 ALOX5基因 单核苷酸多态性

支气管哮喘是由遗传和环境因素引起的下呼吸道慢性炎症性失调。半胱胺酰白三烯（cys-LTs）是参与炎症反应的关键介质，可引起支气管阻塞、组织水肿、嗜酸粒细胞迁移和刺激气道分泌增加。哮喘患者尿液、呼出气体凝结物、痰和血清中均显示cys-LTs水平显著增高[1-4]。ALOX5基因编码的花生四烯酸5-脂氧合酶（5-LO）是白三烯（LTs）和脂氧素（LXs）生成旁路的起始催化酶。在炎症和过敏等疾病中5-LO表达通常升高，可能最终使cys-LTs类代谢产物增加。ALOX5基因启动子区SP-1结合位点（-GGGCGG-）呈现一个插入/缺失多态性，野生型基因转录因子结合位点（-GGGCGG-）为5个（n=5），而突变型基因则增加1、2或3个锌指结构或者减少1或2个锌指结构（non-5），该多态性可引起5-LO表达的改变[5-6]，提示ALOX5基因启动子区插入/缺失多态性可能与炎症和过敏性疾病发生相关。

关于ALOX5基因启动子区插入/缺失多态性与哮喘的关联研究结果目前不尽相同[7-9]，可能主要由于不同人群基因型分布以及不同地区环境因素，研究样本量大小等因素引起。此外，涉及汉族儿童的研究资料更是少见。

因此，本研究以支气管哮喘汉族儿童为病例组，以健康汉族儿童为正常对照组，通过检测两组间等位基因频率、基因型分布及不同基因型个体间ALOX5表达差异，旨在能够初步阐明ALOX5基因启动子区插入/缺失多态性与汉族儿童支气管哮喘发生的关联。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2010-08—2012-10在我院儿科急诊、门诊及住院的汉族患儿。依据2008年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的儿童哮喘防治常规[10]确诊为支气管哮喘的急性发作期儿童患者88例为病例组，年龄6个月～8岁，中位年龄3.2岁；其中男49例，女39例，病程6月～7年，中位数2.8年；选择124例健康儿童为对照组，年龄在6个月～8岁，中位年龄3.2岁；其中男67例，女57例，无呼吸道及其它部位感染以及过敏反应史。各组均除外并发有呼吸衰竭、心力衰竭、先天性心脏病等明显疾病患者；详细记录患者各项临床资料。所有研究对象均对本研究知情同意，签署知情同意书并获得我院医学伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 血标本收集及基因组DNA提取 采集全部对象清晨空腹静脉血3ml，EDTA.K3抗凝，置-20℃冷冻备用。基因组DNA提取采用全血基因组DNA提取试剂盒（北京TIANGEN BIOTECH），按照说明书进行操作，提取的DNA样本采用紫外分光光度法（260/280比值）确定DNA的纯度，OD260测定DNA的浓度。

1.2.2 PCR扩增 ALOX5基因扩增上游引物为5＇-AGGACCAGACACCTCGCTGAGGAGA GAC-3＇，下游引物为5＇-GAGCAGCGAGCGCCGGGAGCCTCGGC-3＇。反应体系为15μl，含50ng基因组DNA，10.0pmol每种引物，0.2mM每种单核苷酸，10×PCR缓冲液（50mM KCl，10mM Tris HCl和0.1%Triton X-100，1.5mM MgCl2和1.0U Taq酶）（大连TAKARA）。PCR扩增条件如下：95℃5min，（95℃ 30s，64℃ 30s，72℃ 40s）×40循环，72℃10min。

1.2.3 ALOX5基因型检测 采用SSCP方法。配制10.0%丙烯酰胺凝胶，每个样品用6×上样缓冲液混合，最终上样量为20μl，1×TAE为电泳缓冲液，以恒定电压为60V电泳2.5h。电泳结束后，胶膜银氨染色后用凝胶成像仪（美国BioRad）观察条带并保存图像。电泳后可以产生的片段分别为255 bp（12bp缺失）、261bp（6bp缺失）、267bp（野生型）和273bp（6 bp插入），相对应于3、4、5和6个SP1结合位点。针对261 bp、267 bp和273 bp条带分别回收凝胶，纯化DNA后以ALOX5基因PCR扩增引物进行双向测序进行基因型确认。

1.2.4 ALOX5 mRNA表达检测 按照基因分型结果，在病例组中选择4/4基因型9例，4/5基因型20例，5/5基因型20例和5/6基因型10例；在对照组中选择4/4基因型9例，4/5基因型25例，5/5基因型25例和5/6基因型10例。用TRIzol（美国英维捷）提取全血总RNA，按照RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas，EU）说明书操作合成cDNA。SYBR Green I实时荧光PCR检测ALOX5 mRNA相对表达量，PCR扩增引物分别为：上游5＇-ACTGGAAACACGGCAAAAAC-3＇，下游5＇-TCACGGGGTAAATCCTTGTG-3＇；以β-actin基因作为内参照，上游5＇-CTACAATGAGCTGCGTGTGG-3＇，下游5＇-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3＇。PCR反应的循环参数为：95℃3min，（95℃10s，60℃45s）×40循环，60℃时收集荧光。根据2-ΔΔCt法来计算ALOX5 mRNA表达量[11]。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，非正态分布的计量资料以中位数表示。Hardy-Weinberg平衡吻合度检验用χ2检验。病例组和对照组间性别、年龄以及基因型和等位基因频率比较采用χ2检验或Fisher精确概率法。ALOX5 mRNA表达量两组间比较采用t检验，3组间比较采用ANOVA检验。关联分析用带有95%可信区间（CI）的比值比（OR）表示。

2 结果

2.1 研究对象一般临床特点 经过对各项资料分析，结果显示有家族史、非母乳喂养、有过敏史和被动吸烟与儿童支气管哮喘发病相关（P＜0.05），而在性别、年龄方面差异无统计学意义（P＞0.05）。哮喘患儿中有83.0%显示过敏原阳性，其中吸入性过敏原阳性占绝大多数（81.4%），详见表1。

表1 支气管哮喘患儿和健康儿童一般临床资料[例（%）]

2.2 ALOX5基因多态性在支气管哮喘儿童组和健康儿童组中等位基因及基因型分布 经PCR-SSCP鉴定可见6种基因型，包括4/4、4/5、4/6、5/5、5/6和6/6；其中4/4、5/5和6/6条带经胶回收、纯化后测序确认，结果完全一致，见图1。ALOX5基因多态性在汉族健康儿童和支气管哮喘儿童中分布情况见表2，该基因等位基因频率及基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.361，P＞0.05）。

由表2可见，等位基因4以及基因型（4/4+4/5）在病例和对照组中分布差异均有统计学意义（均P＜0.05）。2.3 ALOX5 mRNA表达量 ALOX5 mRNA在各组表达量见表3。健康儿童ALOX5 mRNA表达量（0.20±0.14）显著低于哮喘儿童（0.28±0.15）（F=9.639，P＜0.05）；在病例组和对照组中，基因型（4/4+4/5）个体ALOX5 mRNA表达量均高于基因型（5/5+5/6）个体（F=4.194、5.178，均P＜0.05），其余各基因型组间比较均无明显差异（均P＞0.05）。

图1 ALOX5基因多态性鉴定 [A.ALOX5基因PCR-SSCP基因型结果（a：5/6基因型；b：5/5基因型；c：4/5基因型；d：4/4基因型；e：4/6基因型；f：6/6基因型）；B.ALOX5基因4/4基因型测序结果（对应于图A中条带d）；C.ALOX5基因5/5基因型测序结果（对应于图A中条带b）；D.ALOX5基因6/6基因型测序结果（对应于图A中条带f）]

表2 ALOX5基因多态性在支气管哮喘儿童组和健康儿童组中分布[例（%）]

3 讨论

儿童支气管哮喘是西方发达国家最常见的儿童疾病之一，其在我国儿童人群中发病率约达3%，且近些年呈上升趋势。哮喘是一种复杂的多基因疾病，同时受遗传因素和环境因素的双重影响。慢性呼吸道炎症是儿童支气管哮喘的典型特征之一，而且在哮喘患者血清、尿液和呼出气体凝结物中LTs C4、D4和E4水平增高[1-4]。ALOX5是上述产物生物合成途径中的首个催化酶，其基因启动子区SP1结合位点缺失1个或2个（-GGGCGG-）序列可能减少ALOX5 mRNA表达[6]。国内外大量研究证实，在过敏性哮喘、运动性哮喘、阿司匹林哮喘患者中应用ALOX5抑制剂或白三烯受体拮抗剂可明显缓解哮喘症状，提高患者肺功能水平[12-13]。

表3 ALOX5 mRNA表达量

本研究结果显示ALOX5基因在汉族儿童中等位基因、基因型分布与韩国儿童基本相近，在我们的样本中同样未发现3等位基因，东亚黄种人5/5基因型分布低于白种人[8，14]，表明ALOX5基因多态性在人种间分布差异较大。通过关联分析，我们发现携带等位基因4的汉族儿童发生支气管哮喘的风险高于携带等位基因5个体（OR=1.600，95%CI：1.018～2.519），基因型（4/4+4/5）儿童发生支气管哮喘的风险高于基因型5/5个体（OR= 1.903，95%CI：0.989～3.674）。在韩国学者的研究中，携带突变型（non-5）的阿司匹林不耐受哮喘（AIA）患者比野生型具有更严重的气道高反应性，但并未显示突变型是AIA的危险因素。Galván等[14]研究了西班牙人群中ALOX5基因启动子SP-1结合位点多态性与哮喘的关联，结果提示该位点与哮喘发生无关联。造成以上这些矛盾结果，可能与人种、研究方案或样本大小等因素有关。

本研究还分析了病例组、对照组以及不同基因型个体间全血ALOX5表达情况，结果发现健康儿童ALOX5 mRNA表达显著低于哮喘儿童（P＜0.05）；无论是病例组还是对照组，基因型（4/4+4/5）个体表达ALOX5均高于基因型（5/5+5/6）个体（P＜0.05）。该结果表明ALOX5高表达与汉族儿童哮喘可能相关，同时提示ALOX5基因启动子SP-1结合位点可能是一个能影响其表达的功能性位点。Vikman等[15]的研究也表明，在淋巴细胞中3、4等位基因与ALOX5基因高表达相关，通过分析ALOX5基因启动子及第一内含子区域4个CpG岛甲基化情况，发现差异性甲基化的CpG岛位于ALOX5基因启动子SP1结合位点内，进而调控ALOX5基因表达。

因此，本研究提示ALOX5基因启动子SP-1结合位点多态性可能与汉族儿童支气管哮喘相关，该位点能调控ALOX5 mRNA表达。

[1]Rabinovitch N,Zhang L,Gelfand E W．Urine leukotriene E4 levels are associated with decreased pulmonary function in children with persistent airway obstruction[J]．J Allergy Clin Immunol,2006,118 (3):635-640．

[2]Shibata A,Katsunuma T,Tomikawa M,et al．Increased leukotriene E4 in the exhaled breath condensate of children with mild asthma [J]．Chest,2006,130(6):1718-1722．

[3]Kostikas K,Gaga M,Papatheodorou G,et al．Leukotriene B4 in exhaled breath condensate and sputum supernatant in patients with COPD and asthma[J]．Chest,2005,127(5):1553-1559．

[4]Koshino T,TakanoS,Houjo T,etal．Expression of 5-lipoxy-genase (5-LO)and 5-lipoxygenase-activating protein(FLAP)mRNAs in the peripheral blood leukocytes of asthma[J]．Biochem Biophys Res Commun,1998,247(2):510-513．

[5]Drazen J M,Silverman E S．Genetic determinants of 5-lipoxygenase transcription[J]．Int Arch Allergy Immunol,1999,118(2-4): 275-278．

[6]Silverman E S,Drazen J M．Genetic variations in the 5-lipoxygenase core promoter[J]．Am J Respir Crit Care Med,2000,161(2): 77-80．

[7]Kalayci O,Birben E,Sackesen C,et al．ALOX5 promoter genotype,asthma severity and LTC4 production by eosinophils[J]．Allergy,2006,61(1):97-103．

[8]Kim S H,Bae J S,Suh C H,et al．Polymorphism of tandem repeat in promoter of 5-lipoxygenase in ASA-intolerant asthma:a positive association with airway hyperresponsiveness[J]．Allergy,2005, 60(6):760-765．

[9]Kedda M A,Worsley P,Shi J,et al．Polymorphisms in the 5-lipoxygenase activating protein(ALOX5AP)gene are not associated with asthma in an Australian population[J]．Clin Exp Allergy．2005,35(3):332-338．

[10]中华医学会儿科学分会呼吸学组．儿童支气管哮喘防治常规(试行) [J]．中华儿科杂志,2004,42(2):100-106．

[11]Livak K J,Schmittgen T D．Analysis of relative gene expression data using real time quantitative PCR and the 2-ΔΔCtmethod[J]．Methods,2001,25:402-408．

[12]孙铁英,郭岩斐,张洪胜．白三烯在运动性哮喘发病机制中作用的初步探讨[J]．中华医学杂志,2002,82(1):54-56．

[13]Obase Y,Shimoda T,Tomari S,et al．Effects of pranlukast on aspirin-induced bronchoconstriction:differences in chemical mediators between aspirin-intolerant and tolerant asthmatic patients[J]．Ann Allergy Asthma Immunol,2001,87(1):74-79．

[14]Torres-Galván S M,Cumplido J A,Buset N,et al．5-Lipoxygenase Pathway Gene Polymorphisms:Lack of Association With Asthma in a Spanish Population．J Investig Allergol Clin Immunol, 2009,19(6):453-458．

[15]Vikmanl S,Brena M M,Armstrong P,et al．Functional analysis of 5-lipoxygenase promoter repeat variants[J]．Hum Mol Genet, 2009,18(23):4521-4529．

Polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter may be associated with bronchial asthma susceptibility in Chinese Han children

Objective To investigate the association between polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter and bronchial asthma susceptibility in Chinese Han children． Methods Eighty-nine children with bronchial asthma(case group)and 124 healthy children (control group)were enrolled in the study．Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP)were applied to detect the polymorphism of ALOX5．Expression ALOX5 mRNA in peripheral blood was analyzed by real-time PCR in different genotypes of case and control groups． Results Clinical data revealed that family history,non-breastfeeding,history of allergies and passive smoking were the risk factors for bronchial asthma in Han children(P＜0．05)．Six genotypes of ALOX5 were identified by PCR-SSCP,including 4/4,4/5,4/6,5/5,5/6 and 6/6 genotypes．ALOX5 polymorphism in Han children was fitted with Hardy-Weinberg balance(χ2=0．361,P＞0．05)．The distributions of Allele 4 and genotypes(4/4+4/5)in the case and control groups showed significant differences(P＜0．05)．Relative expression levels of ALOX5 mRNA in healthy children(0．20±0．14)was significantly lower than that in asthmatic children(0．28±0．15)(P＜0．05)．The expression level of ALOX5 mRNA in genotypes(4/4+4/5)individuals was higher than those in genotypes(5/5+5/6)(P＜0．05)． Conclusion The polymorphism of SP-1 binding motif in ALOX5 promoter may be associated with the occurrence of bronchial asthma in Chinese Han children,which modulates ALOX5 mRNA expression．

Bronchial asthma ALOX5 gene Single nucleotide polymorphism

2014-05-22）

（本文编辑：田云鹏）

杭州市科技发展计划项目（20110833B06）

310006 杭州市第一人民医院儿科（刘占利、盛文彬、黄先玫、杨一华、冯亚男、黄晖、郑绪阳），基因室（陈岳明）

盛文彬，E-mail：swb8825@163.com