细胞内吞和自噬的新标志物VCP/p97

刘中洋，刘艳，袭荣刚，王晓波

1.沈阳军区 药物研究所，辽宁 大连 116015；2.解放军第210医院，辽宁 大连 116015

含缬酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）是与多种细胞活性相关的三磷酸腺苷酶超家族（ATPases associated with various cellular activities，AAA）中的一员，是糖基磷脂酰肌醇连接的转铁蛋白同系物，又称黑色素转铁蛋白或p97，参与核酸的重建、膜损伤、细胞周期调控等重要细胞活动，具有激活NFκB、抗细胞凋亡、启动转录因子及促进细胞增殖、浸润等作用[1-2]。

p97蛋白在许多泛素化依赖的过程中扮演着中心分子的角色[3-4]。在内质网（ER）相关的降解过程中的p97分子功能研究得最清楚[5]。ER中错误折叠的蛋白被转移至细胞膜的胞质侧，并在此进行泛素化修饰。p97与其辅因子UFD1-NPL4形成复合物，之后与泛素化蛋白结合，并且将它们从质膜上提取出来以促进其向蛋白酶体的传送。同样，p97-UFD1-NPL4复合物也介导多聚泛素蛋白从染色质中分离出来，在某些情况下这些蛋白也被转移至蛋白酶体[5-6]。在调控转录、DNA损伤应答及细胞周期过程中，p97-Ufd1-Npl4的染色质相关活性至关重要，是维持增殖细胞基因稳定性的必需物[7-8]。

除了p97-UFD1-NPL4之外，p97还能与具有其他细胞功能的辅因子形成复合物[5,9]。这些辅因子大都含有UBX或UBX样的泛素化折叠结构域，可调节其与p97蛋白的结合[10]。p97与含有UBX结构域（包括p47或其同源物p37）结合成复合物，指导有丝分裂和调控高尔基体的改造[11]。p97-p47依赖的反应是泛素依赖性的，并且需要p47的泛素结合结构域和去泛素化酶VCIP135的存在[12]。虽然迄今泛素化的靶标仍未确定，但依然表明p97在这些过程中“管理”着一个重要的调控步骤[13]。此外，近年来许多研究将p97与膜介导的胞内运输和自噬联系在一起。有趣的是，这2条途径不是通过蛋白酶体而是通过向溶酶体运送物质进行降解。

1 胞内运输及其泛素化调控

细胞的内吞作用受许多不同机制的调控[14-15]。细胞外的物质和部分质膜蛋白被摄取进入细胞内小泡进而形成早期的胞内体，之后膜蛋白或者被质膜回收再利用，或者被运送至晚期的胞内体和溶酶体进行降解[16]。目前，研究最深的是网格蛋白介导的内吞作用[17]。以复杂的信号传递事件开始，可溶的成分（包括网格蛋白）在细胞膜的胞质侧形成一个膜外套以及集中要运输的“货物”。此外，还有窖蛋白（caveolin，Cav）-1及Cav-1的同系物介导的胞内运输[18-19]。与网格蛋白相反，Cav-1是一种具有能够插入质膜的胞质小叶的发夹状结构膜蛋白，细胞膜内陷形成胞膜窖（caveolae）。

研究表明，内吞小泡融合形成早期的胞内体是受小GTP酶Rab5和它的效应器，如早期胞内抗原（EEA1）调控的[20-21]。招募的分子运至胞内体膜后，能够与Rab5效应蛋白、Rabaptin-5、Rabex-5及膜融合因子NSF装配成大分子复合物[22]。Rab5也能招募磷脂酰肌醇-3激酶Vps34/p150，从而标记早期的胞内体。在成熟至晚期的胞内体过程中，Rab5被Rab7替换[16]。

转运必需内吞体分选复合物（endosomal sort⁃ing complex required for transport，ESCRT）是指一系列的四蛋白复合物（ESCRT-0至ESCRT-Ⅲ），跨膜蛋白从胞内体向溶酶体的选择性运输过程受ES⁃CRT蛋白复合物调节[23-24]。ESCRT复合物的连续能够激活调节绑定物质的浓度、胞内小泡的形成以及将物质分拣至这些小泡，最后ESCRT复合物组分ATP酶超家族的VPS4回收再利用[25-26]。胞内体膜结合之后形成的细胞器，也就是我们所说的多泡体，在细胞核的周围与溶酶体融合之后，囊泡的脂质和蛋白质组分被酸性水解酶降解[27]。其中糖蛋白LAMP1仍然留在膜上，成为晚期胞内体或溶酶体的标记物。

不管是内吞作用还是多泡体的形成都涉及高度调控及蛋白质相互作用。以单泛素、多泛素或短赖氨酸63连接的多聚泛肽链等形式的泛素修饰，在物质分选和调控分选机器中扮演重要角色[28]。在质膜上物质的泛素化起内化信号（如epsin或EPS15）的作用。然而，分选机器的组分包括epsin本身也被泛素化，进而参与蛋白质与蛋白质的相互作用[29]。总之，泛素化的动态性和泛素管理的相互作用网络受到特殊的泛素连接酶和去泛素化酶的调控[30]。

2 VCP/p97在胞吞途径中的作用

上世纪90年代，Pleasure等首次发现p97参与内吞作用，并与内吞小泡膜组件蛋白相互作用[31]。然而，p97对内吞作用功能性的影响及其与内吞转运的关系仍待进一步的研究。2011年，Ramanathan和Ritz分别在自己的研究中揭示了p97与内吞作用的新联系，又一次证明了p97与胞吞途径的组分发生物理作用[32-33]。

p97在胞吞途径的一些步骤中扮演着什么样的角色？它的功能是什么？已证明在各种途径中p97能够提取泛素修饰的靶蛋白[3-4]；相反，泛素化广泛参与胞吞途径不但担任着“货物”蛋白分选信号的功能，还调节着内吞机器的活性和相互作用[28]。同样，Carvalho等认为p97可能不仅在ER相关的降解过程中直接绑定和提取泛素化底物，而且还可能在结构上改造运输机器以提高底物的运输效率[34]。然而迄今的研究数据表明，p97在胞内体中的作用是非蛋白酶体依赖性的，但并不完全排除蛋白酶体的参与。也有报道称交叉递呈过程中，胞内体中底物多聚泛素化会招募p97，将底物提取出来运送至蛋白酶体，并在此进行抗原递呈处理[35]。

此外，p97参与胞内运输也有医学相关性。p97点突变造成显性遗传累及多系统的退行性疾病，称为包涵体肌病与Paget骨和额颞痴呆（inclusion body myopathy with Paget's disease of bone and fronto-temporal dementia，IBMPFD）[36-37]。值得注意的是，疾病相关的突变特异性地废除了p97与其辅因子如UBXD1的相互作用，但对UFD1-NPL4或p47无效[33,38]，同时也影响了Cav-1的绑定[33]。这表明，细胞内吞作用缺陷可能有助于该疾病发病机理的研究。同时，虽然ER相关的降解并没有受损，但自噬也受到疾病相关的p97突变的影响[32,39]。提示p97与自噬的功能和胞内运输有一定的联系。

3 自噬中的VCP与胞内运输潜在的联系

自噬是降解大分子结构如细胞器和蛋白聚集物的过程。自噬起始于双层膜的形成，该双层膜是由泛素样蛋白LC3（LC3-Ⅱ）的脂类形式标记，之后吞噬细胞组分形成自噬体。根据降解的物质不同，可将自噬分为大自噬、核糖体自噬、线粒体自噬及微自噬[40-43]。在许多情况下要降解的物质与泛素结合，在自噬体膜上通过特殊的衔接蛋白p62和NBR1与LC3-Ⅱ衔接起来[44]。自噬体最终与溶酶体结合，对大分子物质进行降解[45]。

Ju等在p97相关疾病IBMPFD中首次揭示p97参与自噬过程。他们发现病人组织切片中富含泛素和自噬标志蛋白p62及LC3B的泡状结构[46]，在表达疾病相关的p97转基因小鼠及组织培养的细胞（p97突变或siRNA干扰p97缺陷）中也得到验证[47-48]。目前已有许多研究表明p97在自噬中的作用[49]。Weihl等发现在p97缺乏时自噬体和溶酶体的融合受到抑制[46]；Taylor等发现，组织蛋白酶D阳性的自噬体中，p97只在自噬体和溶酶体融合之后发挥作用[39]。与哺乳类动物相比，酵母菌的p97同系物Cdc48及其辅因子Shp1（哺乳动物p47的同系物）是自噬体形成过程中所必需的，同时在自噬过程中Shp1和Atg8（LC3的同系物）可以直接相互作用[50]。此外，在核糖体自噬过程中去泛素化的复合物UBP3-BRE5通过与p97及其辅因子UFD3形成三重复合物，从而扮演着十分关键的角色[51]。然而在线粒体自噬过程中可能存在不同的机制。有文献表明，p97帮助蛋白酶体依赖的线粒体融合蛋白降解[52]。从酵母菌中获得的数据也表明，细胞核的零碎微自噬需要Cdc48及其辅因子Shp1的存在[53]。总之，细胞核周围聚集体的形成及聚集蛋白的清除，也是p97的重要功能之一。

4 结语

越来越多的资料已显示p97参与了胞内运输和自噬，现在最重要的是理解在这些细胞过程中p97的基础分子机制。此外，p97可能参与形成更大的功能复合物，诸如膜锚定的招募因子、泛素连接酶、去泛素化酶等。对p97更深入的研究分析将有助于理解这些细胞进程。

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