抑制烟草青枯病型生物有机肥的田间防效研究

刘艳霞， 李 想， 曹 毅， 陆 宁， 石俊雄

(贵州省烟草科学研究院， 贵州贵阳 550000)

烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的一种以土壤传播为主的毁灭性细菌性烟草病害。在我国已经有14个省(区)爆发流行，在长江流域及其以南烟区普遍发生。烟草青枯病的发生、流行和危害是诸多因素综合作用的结果。以往对烟草青枯病的研究和防控主要集中在抗性品种选育、化学药剂防控、土壤添加剂防治及改善栽培管理等方面，防控方法效果都不理想，烟草青枯病至今仍得不到有效的控制。

1 材料与方法

1.1 供试材料

烟草种子采用当地品种MS87，此品种烟叶品质较好，但高感青枯病。

拮抗菌采用实验室前期自安徽省健康烟草根际土壤分离筛选到的L-25(短短芽孢杆菌，Brevibacillusbrevis)和L-9(娄彻氏链霉菌，Streptomycesrochei)，其中，L-25经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(CGMCC No.3175)。

有机肥载体为菜粕酶解的氨基酸有机肥与牛粪以1 ∶1(质量比)混合，含有机质33.8%、氨基酸4.3%、N 4.20%、P2O52.26%、K2O 1.08%。肥料全部由江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室提供。

1.2 抑制烟草青枯病型生物有机肥的制备

将拮抗菌L-25接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，L-9接种于高氏一号液体培养基，三角瓶装液量为1/5，30℃、170 r/m振荡48 h。

表1 拮抗菌二次发酵前后微生物数量(cfu/g)

1.3 田间试验设计

在安徽省宣城市黄渡乡柏枧村分别于2009和2010年开展两年烟草连作定位田间试验。试验前青枯病发病率非常严重，当年已决定不再种植烟草。每年分别设置2个处理：1)对照处理(CK) 只施用975 kg/hm2的烟草专用复合肥料(N ∶P2O5∶K2O=10 ∶15 ∶25)； 2)生物有机肥处理(BOF) 在施用817.5 kg/hm2烟草专用复合肥料基础上加施375 kg/hm2的BOF，磷和钾不足的部分分别用过磷酸钙和硫酸钾补齐。供试土壤含有机质24.2 g/kg、全氮1.32 g/kg、碱解氮143 mg/kg、速效磷10.17 mg/kg、速效钾95.2 mg/kg，土壤pH 6.8。每处理4个重复区组，每区组120株烟株，加保护行等共占地0.07 hm2。田间管理及追肥的施用与当地其他烟田相同。

1.4 田间试验病害调查及相关性状测量

分别于烟草移栽后50和105 d，观测烟草发病情况并测定根际土壤微生物数量及群落结构和功能多样性，烟叶采摘并烘烤后计算各处理产量。

1.4.1 发病率、病情指数与防控效果 分别于移栽后50和105 d，对烟田进行发病率和发病程度的调查测定，以株为单位分组调查病害严重程度：0级—全株无病；1级—茎部偶有褪绿斑，或病侧1/2以下叶片凋萎；3级—茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2，或病侧1/2至2/3叶片凋萎；5级—茎部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达茎顶部，或病侧2/3以上叶片凋萎；7级—茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部凋萎；9级—病株基本枯死[7]。发病率、病情指数与防控效果的计算如下：

发病率=(病株数/总株数)×100%

每克样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数

娄彻氏链霉菌选择性培养基：在高氏一号培养基的基础上加入5 μg/mL的苯唑西啉(oxacillin)、30 μg/mL的头孢噻肟(cefotaxime sodium salt)、50 μg/mL的氨曲南(aztreonam)、200 μg/mL的诺氟沙星(norfloxacin)和20 μg/mL的哌拉西林(piperacillin)，作为拮抗菌L-9选择性培养基。

土壤或肥料总DNA采用Soil DNA Isolation Kit (Omega) 提取，以样品DNA作为扩增模板，分别用病原菌(Ralstoniasolanacearum)与拮抗菌(Brevibacillusbrevis)的特异性引物在荧光定量PCR仪(StepOne Plus Real-time PCR System, ABI)上进行扩增反应，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线，记录每个样品的Ct值，并将Ct值代入标准曲线方程，计算出样品模板的初始基因拷贝数，最终换算出每克干土的茄科劳尔氏菌或短短芽孢杆菌的基因拷贝数。

茄科劳尔氏菌的正向引物flicF：GAACGCCAACGGTGCGAACT; 反向引物filcR：GGCGGCCTTCAGGGAGGTC[9]。短短芽孢杆菌L-25的正向引物Bre-F：AGACCGGGATAACATAG GGAAACTTAT; 反向引物Bre-R：GGCATGCTGA TCCGCG ATTACTA GC[10]。荧光定量PCR扩增反应体系(20 μL)含SYBR® Premix Ex TaqTM (2×) (Takara) 10 μL、 ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、 flicF 0.4 μL、 filcR 0.4 μL、 DNA模板 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反应程序：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。溶解曲线步骤为95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线。

荧光定量PCR结果显示，茄科劳尔氏菌的扩增效率达到91%，短短芽孢杆菌的扩增效率达到100%，标准曲线R2>0.99。茄科劳尔氏菌标准曲线方程为CtR=-3.564C0R+38.744，短短芽孢杆菌标准曲线方程为 CtB=-3.322C0B+37.209。

计算土壤微生物群落功能多样性指数分别由Shannon多样性指数(H)、Simpson优势度指数(D)和McIntosh均匀度指数(U)来表示[11]。

H=-∑PilnPi

其中Pi为第i孔相对吸光度值与整个平板相对吸光度值总和的比率；

其中，ni为第i孔的相对吸光值，N为相对吸光度值总和。

1.5 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2003处理，显著性分析采用SPSS Base Ver.13.0统计软件 (SPSS, IL, Chicago, USA)进行，用LSD、Duncan 新复极差进行多重比较(P≤0.05)。

2 结果与分析

2.1 青枯病的防控效果

大田中连续两年施入生物有机肥后，青枯病的发生情况显著减轻，BOF处理中发病株数和发病程度都明显降低，青枯病初发期比对照延迟13天(表2)。第一年和第二年CK处理移栽50 d后的发病率和病情指数无显著差异；而BOF处理的发病率和病情指数都存在显著差异，第二年50 d的防控效果比第一年高14.0个百分点，105 d发病率降低了94.1%，防控效果高达95.4%。各处理50 d的发病率均显著低于105 d，分别为105 d发病率的43.1%(1-CK)、25.9%(1-BOF)、45.4%(2-CK)和32.2%(2-BOF)。BOF处理50 d对烟草青枯病的防控效果高于105 d，分别为105 d的1.09(第一年)和1.01倍(第二年)。

表2 大田试验田间小区防控效果

2.2 烟叶产量

两年田间试验结果都表明，施用生物有机肥可以显著增加烟叶产量(图1)。与CK处理相比，BOF处理第一年增产2.4倍，第二年增产2.6倍，CK处理两年间产量无显著差异，BOF处理第二年产量显著高于第一年，比第一年增加11.9%。

2.3 烟草根际土壤微生物数量

移栽50 d后，BOF处理根际的细菌、放线菌和拮抗菌的数量都比CK处理明显提高，而真菌和病原菌的数量却显著减少(P≤0.05)，病原菌数量由CK处理的107cfu/g，土下降到106cfu/g， 土(表3)。移栽105 d后，各种微生物数量也呈下降趋势，细菌数量与50 d相比下降一个数量级，BOF处理的拮抗菌数量分别减少23.2(第一年)和14.8倍(第二年)；病原菌茄科劳尔氏菌的数量在两处理间没有显著差异，都在1.0×106cfu/g土数量级上；放线菌数量在数量级上也无差异。

2.4 烟草根际土壤微生物群落功能多样性

土壤中施入生物有机肥的处理Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh指数均高于病土CK处理(表4)，表明生物有机肥可以有效改善土壤微生物的多样性，而长期施用化肥会降低土壤微生物的丰富度和均匀度。两年的试验结果表明，第一年BOF处理Shannon指数、Simpson指数和Mclntosh指数显著高于CK处理，50 d增幅分别为28.4%、 76.9%和10.6%；第二年BOF处理土壤微生物群落功能多样性指数与CK处理相比差异明显，50 d增幅分别为36.2%、 86.3%和19.1%，烟株移栽105 d后的根际土壤微生物群落功能多样性比50 d有所下降，但BOF处理仍显著高于CK处理。BOF处理第二年根际土壤微生物群落50 d Shannon指数和Mclntosh指数显著高于第一年，Simpson指数无差异，105 d Shannon指数、Simpson 指数和Mclntosh指数均显著高于第一年。

图1 施用生物有机肥对烟叶产量的影响Fig.1 Effect of the application of BOF on tobacco yield

2.5 烟草根际土壤微生物群落结构多样性

从图2可以看出，与CK处理相比，BOF处理细菌的条带增加了，真菌条带减少了，即细菌种类增加的同时真菌的种类有所减少。通过DGGE图谱的相似性聚类分析发现，两年BOF处理的细菌和真菌群落结构具有相似性，CK处理的细菌和真菌群落结构也具有相似性。

表3 烟草根际土壤可培养微生物数量(cfu/g, soil)

3 讨论与结论

有机肥与功能微生物(生防菌、促生菌等)相结合制成微生物有机肥后施用，对各种土传病害的防控体现出很好的效果[12-13]，目前国内报道的生物有机肥对香蕉枯萎病[14-15]、黄瓜枯萎病[16]、甜瓜枯萎病[17]、西瓜枯萎病[18]、棉花黄萎病[19]等具有较好的防控效果。本试验中，生物有机肥处理青枯病的发病率和病情指数较对照相比显著下降，防控效果分别达到75.2%(第一年)和95.4%(第二年)。此外，生物有机肥还能延缓青枯病的发病时间，初发期推迟13 d，移栽后50 d的防控效果分别比105 d高9.3%(第一年)和1.2%(第二年)。这主要由于采用的拮抗微生物均从烟草根际土筛选获得，在烟草根际上具有很强的定殖能力；同时拮抗菌以有机肥为载体，经过二次固体发酵后施入土壤中，在土壤中的定殖能力更强，对病原菌起到较好的抑制作用[20]，进而推迟烟草植株发病时间和显著降低青枯病发病指数。

图2 移栽105天烟草根际土壤的细菌(左)和真菌(右)DGGE电泳图及聚类分析Fig.2 DGGE pattern and the phylogenetic tree of the bacterial community (left) and fugal community (right) of rhizosphere soil in different treatments in the pot experiment

生物有机肥对土壤中青枯病病原菌有较好的抑制作用，主要是因为其有效改善土壤微生物平衡，恢复被破坏的土壤生态系统，从而建立起复杂而健康的土壤微生物体系[23]。拮抗菌在有机肥协助下形成“基质-菌群”生态系统，更有利于调节土壤微生态环境，可改变根际土壤微生物生态特征和物理化学特征，从而起到防病、抑病的作用[24]。本试验中生物有机肥处理根际土壤中的细菌和放线菌的数量较对照处理均显著增加，真菌的数量下降明显，土壤微生物由真菌主导型向细菌主导型转化, 土壤趋向健康方向发展[25]。生物有机肥在根际不但可以影响土壤的微生物数量，还可以调节微生物的群落多样性和功能多样性。本试验中通过DGGE方法分析发现，与对照相比，生物有机肥处理中细菌的条带显著增多，真菌条带明显减少，从而说明，生物有机肥可以调节土壤微生物群落的结构多样性，这一结果与张慧[26]和Lang等[27]通过DGGE分析生物有机肥对棉花根际土壤真菌区系的影响类似。当土壤肥力水平提高、微生态环境得到改善、微生物活性增强时，土壤微生物群落功能多样性会提高[28-29]。本试验中，生物有机肥处理土壤的Shannon多样性指数、Simpson优势度指数和McIntosh均匀度指数都显著高于对照，说明生物有机肥不但提高了土壤微生物整体代谢能力和数量[30]，即增加土壤微生物功能多样性，而且微生物群落间无绝对优势种群，对土壤中各种碳源的利用更加均衡，从而达到改善土壤微生物区系的目的，使土壤健康、可持续发展。

综上所述，施用抑制烟草青枯病型生物有机肥可以有效降低青枯病发病率，增加烟叶产量，降低土壤中病原菌浓度进而减少病原菌对根系的侵染，有利于连作土壤的生态系统向健康可持续发展的方向转化，达到对烟草青枯病良好的防控效果。

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