外体和病毒感染

张晓阳，董春艳，段铭

吉林大学人兽共患病研究所/人兽共患病研究教育部重点实验室，动物医学学院，吉林 长春 130062

外体（exosome）是一种直径为30～100 nm 的源自细胞内体（endosome）的小囊泡，是细胞分配和区划管理其内生物大分子的途径之一。1987 年，Johnstone 及其同事在网织红细胞变成成熟红细胞的研究中首次发现了这一特化的“细胞器”[1]。现有研究结果证实，许多哺乳动物的细胞都能分泌外体，例如肠上皮细胞、肥大细胞、成纤维细胞、血小板、抗原递呈细胞、肝细胞、淋巴细胞及肿瘤细胞。被释放的外体可与受纳细胞表面的受体结合，通过与细胞膜融合，将其内含有的生物大分子释放入受纳细胞，从而影响和调控系列的生物学进程，如血管生成、细胞增殖、基因表达和免疫应答等。细胞可通过动态地改变外体的分泌、释放和内容物的组成来应答多样化的生物学事件（包括微生物的感染）[2-4]。

病毒是严格寄生于宿主细胞的一种传染性因子。病毒感染致病涉及病毒与机体两个复杂生物系统及其二者间的相互作用。一方面，宿主表现出对病毒感染的主动限制；另一方面，病毒会主动地使宿主细胞为其感染和复制提供必需的细胞机器。外体作为一种特化的“细胞器”，必不可少地出现在了病毒和宿主细胞相互作用的过程中。在此，我们以介绍外体的组成和生物发生为基础，综述近年来其在病毒感染致病中的研究成果，以期为病毒感染致病机理的研究提供新的切入点。

1 外体的组成

外体是一种细胞内源性的具有双层膜结构的小囊泡，由蛋白质、脂类和核酸参与构成，其结构和内容物的组分由分泌外体的供体细胞的类型、功能及细胞外的生物学微环境所决定。研究人员应用质谱法、蛋白质免疫印迹法和薄层色谱法等系列方法，对外体的组分进行了分析和鉴定。

外体的蛋白质组分分为两大类，即遍存于各类型细胞分泌外体的非特异性蛋白和仅存在于某种特定细胞源性外体的特异性蛋白。其中前者是维持外体生物发生、结构及功能的必需蛋白质[3]，例如参与构成细胞骨架的蛋白（肌动蛋白、肌球蛋白重链及微管蛋白等）、黏附分子（CD11、CD13、CD18 等）、膜融合相关蛋白（膜联蛋白和网格蛋白重链等）、代谢酶（转酮醇酶、醛还原酶、ATP 柠檬酸裂解酶等）、分子伴侣（热激蛋白70、84、90 等）、多囊泡体（multi-vesicular body，MVB）形成蛋白（Alix和Tsg101 等）、T细胞刺激分子（CD86、MHCⅠ和Ⅱ等）等，部分蛋白质组分的功能尚待进一步研究[4]。而后者主要是源自释放外体的供体细胞中的特异性蛋白，并执行特定的生物学功能，例如来自受感染细胞的包含有病原抗原的外体能够激活树突状细胞（dendritic cell，DC）和巨噬细胞等天然免疫细胞[3]。

人们对于外体中脂质组分的研究结果有限，目前仅对网状细胞、肥大细胞、DC和B 淋巴细胞所分泌外体的脂质组分做了些许研究。结果表明，外体膜上的脂质主要有鞘磷脂、溶血卵磷脂、饱和脂肪酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇和胆固醇等。由于外体的来源不同，其脂质组分的含量和功能也各不相同，例如溶血磷脂酸是一种对MVB的结构及外体的生物发生都非常重要的脂质[4]。

此外，大量新近研究结果证实，外体还可将mRNA和microRNA（miRNA）从供体细胞运输至受纳细胞，进而调控受纳细胞的基因表达和生物学功能[5]。例如，神经元特异高表达的miR-124可借由外体进入星形胶质细胞，上调星形胶质细胞内GLT1蛋白的表达量，促进其对谷氨酸的摄取[6]；吗啡和人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的Tat 蛋白刺激星型胶质细胞内miR-29 的表达，过多的miR-29 通过外体传递至神经元后会造成神经元的损伤[7]。

2 外体的生物发生

细胞内体是动物细胞内由膜包围的具有囊泡结构的细胞器，是细胞囊泡运输的枢纽环节和分选中心。外体的生物发生依托于内体，其过程可分为两个步骤：首先，在内体膜上完成生物大分子的分选；其次，内体通过向腔内反向内陷出芽的方式产生小囊泡，小囊泡逐渐增多聚集后的内体又被称为MVB，MVB 与细胞膜融合后即可将其内小囊泡即外体释放进入细胞外间隙[4]。

MVB 的生物发生分为主动和被动两种方式。主动方式需要许多特定蛋白和脂类分子的参与，例如泛素化是将蛋白分子分选进入MVB 的机制之一。内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT）系统是真核细胞中完成膜蛋白分拣的重要分子机器，包括ESCRT-0、-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ和Vps4-Vta1 共5 个蛋白-蛋白复合物，能识别泛素标记。泛素标记的“待转运”蛋白分子被转运到内体膜上，通过ESCRT 系统将含有这些蛋白分子的膜组分分选并内陷出芽形成小囊泡，释放入内体腔中。MVB形成后，ESCRT系统会从MVB膜上分离，再去参与转运新的蛋白分子[8-9]。

被动方式是一种不依赖于泛素化的蛋白分子分选机制。蛋白质分子首先聚集，聚集后的蛋白分子会表现出新的物理特性和微结构域，而ESCRT 系统可与微结构域依次发生相互作用，从而将待分选分子转运进入MVB[10-11]。此外，脂筏中富含的四跨膜蛋白或胆固醇可参与自身的被动分选[10]。

3 外体与病毒感染

受病毒感染的宿主细胞分泌的特异性外体中所包含的功能蛋白、mRNA/miRNA、病原组分等，因病毒类型、病毒的生命周期，以及受感染细胞类型的差异而有所不同。在病毒感染和致病的进程中，外体作为细胞间“通讯”交互的工具可为病毒和宿主同时利用，作为感染致病和抗病毒效应的媒介。

3.1 参与病毒的免疫逃避

哺乳动物虽具有完整的、高度进化的免疫保护系统，有些病毒仍能在其中长期存在。这主要是由于病毒在长期的宿主免疫选择压力下产生了多种对抗宿主免疫系统的机制。HIV 的Nef 蛋白不具酶活性，具有衔接蛋白的作用，可下调CD4、主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ和Ⅱ等分子，在对抗宿主免疫应答过程中发挥重要作用。研究发现Nef 可以促进细胞内MVB数量的增加和外体的分泌，同时借助外体促进Nef从受感染细胞运出[12-13]，从而远程发挥Nef 的功能，例如诱导CD4+T 细胞凋亡[14]。免疫活性细胞上的人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）具有向抗原特异性T 细胞传递抗原多肽的生物学特性。1 型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus-1，HSV-1）编码的糖蛋白B 可以和HLA-DR 分子形成复合体，改变HLA-DR在细胞内的转运途径，使其不能正常转运至细胞膜，而是通过外体的方式释放至细胞外，最终抑制了抗原递呈[15]。Klibi[16]等发现，EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染的鼻咽癌细胞释放的外体中包含有半乳凝素-9。半乳凝素-9 及其受体Tim-3 信号通路的活化可抑制CD4+和CD8+T 细胞，产生抑制信号，导致Th1 淋巴细胞凋亡和抑制Th1型免疫。EBV通过外体将半乳凝素-9递送至受纳细胞后，可以诱导EBV特异的CD4+T细胞凋亡和抑制Th1型免疫。

3.2 参与病毒的感染和致病

HIV 实现有效感染宿主细胞需要其特异受体CD4 分子和辅助受体CXCR4 或CCR5 的存在，这些受体分子的分布决定了HIV的细胞亲嗜性。有研究表明，外体可以将CXCR4 或CCR5 递送至该受体阴性的受纳细胞，从而局部增加了HIV 易感细胞的类型，扩大了HIV的感染范围，为病毒提供了新的存在场所[17-18]。Kadiu 等[19]通过对HIV-1感染单核细胞源性巨噬细胞分泌外体的组分鉴定，证实其包含有病毒粒子、病毒的组分、细胞因子（IL-3、IL-4、IL-8和TNF-α 等）、抗原递呈效应分子（HLA-DRA1和HLA-DRB1 等）和黏附分子（fibronectin 等）等，同时功能学研究结果表明外体作为参与者协助了HIV-1的感染及其在机体内的散播。EBV编码的潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是一个具有信号转导能力的癌蛋白。EBV感染的宿主细胞可通过分泌包含LMP1 的外体来激活受纳细胞内的ERK和AKT 信号通路，进而影响受纳细胞的生长、介导免疫抑制、调节肿瘤微环境[20-21]。Meckes等[20]在EBV感染的B 细胞和未感染的单核细胞来源的DC（monocyte-derived DC，MDDC）共培养的实验中发现，EBV 编码的miRNA 出现在MDDC 中，而miRNA递送是通过外体的途径来完成的，功能上表现出抑制受纳细胞内靶基因的表达（如CXCL11），进而有助于病毒持续性感染的建立。HSV感染细胞分泌的外体可以将病毒的被膜蛋白和糖蛋白等转运至未感染的受纳细胞，其生物学效应包括促进潜伏期病毒的再激活、协助病毒感染半受纳型细胞和增加病毒感染成功的几率等[22]。在丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）的研究中，Ramakrishnaiah 等[23]证实HCV 感染细胞释放的外体可将病毒的RNA和蛋白递送至临近的细胞，并建立增殖性感染。

3.3 参与宿主的抗病毒应答

宿主的抗病毒免疫由非特异性和特异性免疫两部分组成。前者包括组织屏障、非特异性免疫细胞和非特异性免疫分子；后者由特异性体液免疫和细胞免疫组成。呼吸道分泌的黏液是呼吸道局部非特异性免疫的重要组成部分。研究发现，人的气管、支气管上皮细胞所分泌外体的蛋白组成包括了带有α-2，6 唾液酸修饰的黏蛋白，初步的功能学研究表明该外体可以有效地中和流感病毒，具备非特异性黏膜免疫的生物学功能[24]。滋养层细胞是胎盘屏障的重要组成部分，是胎儿避免宫内感染的重要原因。定位于染色体19q13.41 的miRNA 簇为胎盘专有表达，滋养层细胞可通过外体将该miRNA 簇递送至受纳细胞，通过诱导自噬来弱化病毒在受纳细胞内的复制[25]。人胞嘧啶核苷脱氨酶家族的APOBEC3G（A3G）蛋白可诱导HIV的DNA上的胞嘧啶替换为尿嘧啶，导致完整的前病毒数量减少，阻止HIV复制。Khatua 等[26]的研究结果表明，宿主细胞分泌的外体可将A3G 蛋白递送给受纳细胞，并抑制受纳细胞内HIV 的复制。此外，在EBV 的研究中发现，源自EBV 转化B 细胞系的外体包含有EBV 的糖蛋白gp350，由后者和B细胞表面CD21发生相互作用，进而使得外体可特异性地靶向B 细胞，该相互作用可以抑制EBV 对原代B 细胞的感染，具有调控EBV感染的作用[27]。Admyre 等[28]将MDDC 与23 个来自EBV、人巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）和流感病毒的免疫原性多肽共同孵育，后使用培养上清中提取的外体处理自体同源的CD8+T 细胞，结果表明该外体以抗原特异的方式激活了CD8+T 细胞的免疫应答。Walker 等[29]发现，CMV 感染的内皮细胞可以通过外体将病毒抗原递呈至抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC），激活CMV 特异的CD4+T细胞应答，说明这种源自受感染细胞、具有免疫原性的外体在机体内起到了免疫监视的作用。在流感病毒的研究中同样发现外体参与了病毒抗原的递呈过程[30]。

综上所述，外体在病毒和宿主相互作用的过程中扮演了重要的角色。一方面，病毒可主动借助外体作为载体，利用其分泌途径，实现免疫逃避、感染的扩散、宿主细胞内的增殖，以及建立持续性感染等；另一方面，宿主细胞也可利用外体来抵抗和限制病毒的感染。因此，理解病毒和宿主外体间的相互影响，不仅能使我们深入洞悉病毒感染致病的分子机制，同时将会为研发新的抗病毒干预措施和疫苗提供新的思路。

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