健脾解毒汤对人大肠癌细胞HT-29 基质裂解蛋白-9基因表达及蛋白分泌影响的实验研究

徐 磊，杨 静，吕 茜，韩 东

随着生活习惯和饮食结构等因素的改变，我国大肠癌的发病率和病死率呈逐年上升的趋势。术后发生复发、转移是大肠癌患者死亡的主要原因。中医药已经被证实对防治肿瘤复发、转移有确切疗效，并成为近年来肿瘤学的重点[1-2]。大量中医临床治疗表明，健脾解毒汤在改善和控制晚期病人的临床症状，对放化疗的增效减毒、改善骨髓抑制及延长生存率等方面都取得了较好的效果[3]。本实验采用健脾解毒汤进行体外细胞培育的方法，通过检测人大肠癌细胞HT-29与癌转移密切相关的MMP-9基因表达与蛋白分泌的变化，旨在探讨健脾解毒汤抗大肠癌复发、转移的可能分子机制。

1 材料

1.1 细胞及培养 人大肠癌细胞株HT-29(由徐州医学院细胞室惠赠)用加入1.5 g/L NaHCO3和10%胎牛血清的含有1.5 ml谷氨酰胺的McCoy’s 5a培养液复苏后，静置于37 ℃，含5%CO2，95%O2相对湿度的培养箱中培养4～5天，隔天换液1次，待贴壁长满达瓶底面积的80%时，加入适量0.25%胰酶消化液消化传代，两代之后用于实验。

1.2 药物组成 健脾解毒汤基本方由黄芪、山药、生薏苡仁、炒薏苡仁、红藤、蛇舌草各30 g，炒白术、败酱草各15 g组成；加减后以清热解毒、活血化瘀、补脾益气、补血益气及扶助正气等功效分为：清利方加用苦参10 g，半枝莲、蒲公英各30 g，猪苓、茯苓、三叶青、马齿苋各15 g；活血方加用广木香5 g，绿梅花12 g，丹参30 g，延胡索、赤芍、佛手各15 g；温补方加用党参20 g，补骨脂15 g，炮附子、吴茱萸各10 g；滋阴方加用灵芝30 g，天冬、麦冬、五味子、女贞子各15 g，山茱萸10 g，枸杞子、南北沙参各20 g；补气血方加用赤芍、熟地各15 g，当归、川芎、阿胶各10 g，鸡血藤30 g。由南京中医药大学附属徐州中医院肿瘤科及药剂科负责制剂和质量控制。

1.3 试剂与仪器 DMEM/F12和M199培养基购自Gibco公司；胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司；L-谷氨酰胺购自Sigma公司；人基质金属蛋白酶9(MMP-9)ELISA试剂盒(Human MMP-9 96-Well Plate Assay)购自苏州卡尔文生物科技有限公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；One Step RT-PCR Kit 购自TaKaRa公司；电热恒温浴槽购自成都仪器厂，高速离心机购自Beckman Avamti J-E，恒温水浴箱购自JEIO TECH公司，纯水系统购自PALL公司，显微镜购自Olympus公司，培养箱购自Forma公司，全波长酶标仪购自瑞典TACAN公司。凝胶电泳系统、半干转系统均购自Bio-Rad公司，显微摄像系统购自日本Olympus公司。

2 方法

2.1 中药水提物的制备 各方剂中药按其干燥重量的7倍为加水量，室温条件下浸泡30 min，然后分别煎药30 min 2次，将其上清液收集后静置于4 ℃冰箱过夜，用3 000转/min离心15 min，再将其上清液收集，冷凝真空干燥，将形成的粉末置于干燥器中备用，依据各方剂中药的不同提率，使用前称取药粉溶于McCoy’s 5a培养基中，用0.22 μm直径筛网的滤器过滤灭菌，使母液浓度为5 mg/ml，使用前稀释成所需的浓度。

2.2 磷酸缓冲液(PBS)的制备 将PBS的固体盐先用0.2N的PB溶液溶解，再加900 ml的纯水，混匀后调节pH值(7.2～7.4)，加水至1 000 ml, 4 ℃保存备用。

2.3 分组及细胞活力测定 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整浓度至(5～10)×104。将接种好的细胞培养板放入细胞培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入梯度浓度的药物(细胞贴壁后即可加药)，每孔100 μl，设3个复孔。5%CO237 ℃孵育16～48 h，倒置显微镜下观察药物作用效果。然后，每孔加入100 μl MTT溶液，继续培养4h，除去培养液，终止培养。加入二甲基亚砜(DMSO，150 μl/well)，在室温下震荡5～10 min，溶出色素，运用全自动酶标仪于570 nm，设置调零孔、对照孔，测定其溶出液的吸光度，重复3次，取其均值，运用以下公式计算出细胞增殖的抑制率：

2.4 RT-PCR方法检测HT-29细胞MMP-9mRNA基因表达水平 各实验组加入中药，空白对照组加入McCoy’s 5a培养液作用24 h。弃掉培养液，以PBS冲洗3遍，然后使用TRIZOL Reagent(LTI)提取细胞总RNA，按照试剂盒说明书步骤进行操作。核酸分析仪定量，检测纯度和含量，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性，每组的每个样本取总RNA 2μl加入去离子水1ml，分别在分光光度计260nm和280nm处读取OD值(OD260nm/OD280nm在1.8以上者方可使用)。总RNA浓度=OD260nm×20 (μg/μl)，使用前取1μg RNA用于逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，反应体系为25 μl，每一反应体系中含总RNA 1 μg，上游引物和下游引物的终浓度为0.5 μM。MMP-9、GAPDH经过扩增后，各组取1 μl扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果拍照，采用凝胶成像系统进行光密度扫描(OD)，以各组MMP-9条带OD和相应的GAPDH条带的OD比值表示MMP-9mRNA表达的强弱。

2.5 ELISA方法检测HT-29细胞MMP-9蛋白分泌量 收集药物作用24 h后的各组培养上清液，经3 000转/min离心15min后，取2m1上清液用由武汉博士德生物工程有限公司生产的基质金属蛋白酶-9(总)ELISA试剂盒(Human total MMP-9 ELISA Kit)检测MMP-9。按说明书进行操作，96孔微滴板孔中被覆纯化级多克隆抗体。最后用酶标仪在450 nm测定OD值，将零孔设为对照，在坐标纸上绘制标准曲线，以吸光值(OD)作为纵坐标，以浓度作为横坐标。依据样品的吸光值在坐标上找出相应的浓度，再乘以样品稀释倍数。

3 结果

3.1 各组中药水提物对HT-29细胞增殖的影响 细胞经过48 h培养后，各组中药对HT-29细胞均有不同程度的抑制作用。在同方剂组中，高浓度(1 000 μg/ml)的抑制率要明显高于低浓度(500 μg/ml)。其中，滋阴组在1 000 μg/ml浓度时抑制率达46.1%，是抑制率的峰值，较基本方及清利组有显著性差异，P<0.05，见表1。

表1 健脾解毒汤各方对人大肠癌HT-29细胞生长抑制率(%)

3.2 各组中药水提物对HT-29细胞MMP-9 mRNA基因表达的影响 在健脾解毒汤干预下，各组HT-29细胞的MMP-9 mRNA基因表达水平被不同程度下调，其中滋阴组的下调作用最为明显，其后依次为活血组、温补组，均与空白组和对照组比较有显著性差异(P<0.01)(图1)。

3.3 各组中药水提物对HT-29细胞MMP-9蛋白分泌的影响 HT-29细胞在健脾解毒汤干预下，各中药组两种浓度均显示具有抑制肿瘤细胞的MMP-9的蛋白分泌的作用，与空白组和对照组比较有显著性差异，P<0.01。其中，以滋阴组于1 000μg/ml浓度时MMP-9蛋白分泌减少最为显著，且较基本方法组、清利组差别有统计学意义(表2)。

表2 各组中药水提物对HT-29细胞MMP-9蛋白分泌的影响

图1 健脾解毒汤各方对HT-29细胞MMP-9 mRNA基因表达的影响

4 讨论

大量的临床资料表明，大肠癌即使在早期切除原发肿瘤，仍然会有许多患者发生复发或远处转移最终导致死亡[4]。因此，寻求肿瘤浸润转移的靶系统成为近年来的临床研究热点[5]。大肠癌转移是癌细胞和宿主细胞或细胞外间质的相互作用的多步骤的复杂过程。其中，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)对细胞外基质(ECM)及基底膜(BM)的降解在肿瘤侵袭和转移中起关键性作用，是迄今发现的与肿瘤侵袭转移关系最密切的一类蛋白水解酶。MMP-9是MMPs家族的主要成员之一。在以往的研究中发现，MMP-9在大肠癌组织中有较高的表达，而且与癌的浸润、转移密切相关[6]。近年来，以健脾活血解毒中药治疗和预防大肠癌术后复发转移逐渐受到重视，且在临床治疗中取得了良好的疗效[7]。我院自拟健脾解毒汤方中黄芪、白术益气健脾为君，薏苡仁、山药健脾利湿为臣，红藤、蛇舌草、败酱草功用清热解毒，活血祛瘀为佐使药，全方具有益气健脾、解毒散结功效[8-9]。针对不同征候的中晚期大肠癌患者，通过对基本方进行辨证加减，在改善患者术后放化疗副反应、降低肿瘤复发转移及延长患者生存期等方面取得了满意疗效。

本实验发现，健脾解毒汤基本方及其各加减方对人大肠癌HT-29细胞均有不同程度的抑制作用，且具有浓度依赖趋势。其中，滋阴组在1 000 μg/ml浓度时达到抑制率的峰值(46.1%)，其后依次为活血组、补气血组、温补组、基本组及清利组，且较基本方及清利组有显著性差异(P<0.05)。同时，各中药组方使与癌转移密切相关的MMP-9基因的mRNA表达及蛋白分泌水平下调，并与抑制肿瘤细胞增殖的组间分布特点一致。因此我们推测，滋阴方中增加的中草药，有一种或多种药物具有较强的抑制肿瘤细胞增殖的作用，从而使滋阴方比其他组方具有更强的抗肿瘤作用；或者滋阴方中增加的中草药成分与基本方中的药物可能存在协同或增强作用，从而增强了基本方的抗肿瘤作用。而其抗肿瘤细胞转移的机制可能为通过阻断MMP-9信使核酸的表达，进一步影响其功能蛋白的分泌，从而达到抑制癌细胞的浸润和转移的作用。滋阴中药则在此抗肿瘤转移的机制中起到关键的作用。

参考文献：

[1] 窦丽萍，钟薏.中医药干预大肠癌转移的临床和实验研究进展[J].西部中医药，2013,26(1):125-128.

[2] 左振魁.健脾解毒汤预防结直肠癌根治术后复发转移的3年随访研究[J].中国中医基础医学杂志,2013,19(7):808-811.

[3] 黄兆明,黄振步,陶玉.健脾解毒法治疗术后结直肠癌88例[J].江西中医药，2010, 41(330):28-30.

[4] 吴东辉,秦爱军,朱晏伟.XCL12/CXCR4信号转导通路在大肠癌转移分子机制中的研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2010,12(9):200-202.

[5] 姚路明.基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9含量表达与大肠癌浸润转移相关性研究[J].吉林医学，2012,33(34):7461-7462.

[6] Langenskiold M，Holmdahl L，Falk P，et al.Increased plasma MMP-2 protein expression in lymph node-positive patients with colorectal cancer[J].Int J Colorectal Dis，2005，203: 245.

[7] 丁宁,杨宇飞,刘羿男,等.健脾活血解毒法拆方含药血清对人大肠癌细胞HCT-116细胞的增殖抑制作用及其机制研究[J].中国实验方剂学杂志，2013,19(11):272-275.

[8] 劳高权,陈 丰,何小华，等.健脾解毒汤配合化疗治疗晚期大肠癌的临床研究[J].中医临床研究，2012, 4 (17):1-4.

[9] 成玲玲,许建华.健脾解毒法对晚期结直肠癌患者生存期的影响[J].辽宁中医杂志，2013,40(8):1623-1626.