细菌鉴定方法

邓梅葵，孙 迎，韩雯晴

上海理工大学医疗器械与食品学院医学信息工程研究所(上海，200093)

细菌鉴定方法

邓梅葵，孙 迎，韩雯晴

上海理工大学医疗器械与食品学院医学信息工程研究所(上海，200093)

细菌的分类鉴定与细菌的研究和应用有着同等重要的地位。准确地鉴定细菌类别，根据其菌种种类不同，分别针对肠杆菌、阳性球菌、非发酵菌等菌种设计不同药敏板条的抗生素组合，可以指导临床应用用药。目前，细菌分类鉴定方法主要包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类，针对这两大类鉴定方法，汇总其生理生化分类特征，简述各方法采用的关键技术，针对各技术讨论其优缺点。同时详细研究了表型鉴定法下数值分类法中自动化鉴定涉及的算法，结合目前细菌鉴定方法，对细菌分类鉴定的发展趋势进行了总结和展望。

细菌；分类鉴定；自动化鉴定

0 前言

目前，正式发表的细菌种类已达到9 916种之多，且仍在快速增长，据估计自然界存在的细菌种类总数在105～106之间，还有巨大数量的细菌新种类有待于科学家去发现。微生物个体微小、结构简单，分类和鉴定方法较多。分类鉴定主要是从以下4个水平分别进行：细菌形态与生理生化水平、蛋白质水平、细胞组分水平和核酸水平。前3个水平的鉴定方法可以统称为表型鉴定法，其中包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法；核酸水平鉴定的方法主要有分子遗传学鉴定法，主要是对细菌染色体或质粒DNA进行分析，包括G+C mol %含量测定、核酸杂交、PCR技术、16S r RNA和16～23SrRNA序列分析、全基因组测序等[1]。随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用，微生物菌种鉴定渐渐地由传统的形态学观察和人工、生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段。本文将以细菌分类鉴定方法为主线，对各种方法做出详细的介绍和总结[2]。

1 细菌常规鉴定法

1.1形态学鉴定法

从细菌形态与生理生化水平和蛋白质水平鉴定，称之为细菌常规鉴定法。传统的分类鉴定方法主要依赖于表型分析、个体形态学观察，主要观察菌落在其适合的培养基上的生长状况[3]：细菌在固体培养基上的生长形态、大小、颜色是否均匀一致，菌落个体表面及边缘的生长状况；在液体培养基上的浑浊状况、沉淀状况、液面菌膜状况；半固体上穿刺接种后，观察细菌生长状态。在鉴别培养基上培养，观察结果是否跟预期结果相同。

形态学鉴定辅以生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义，生化试验是根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各异，表现出不同的生长特性[4]。通过生物化学的方法来检测这些物质的存在与否，从而能够得到细菌的鉴定结果。如糖(醇)类代谢试验、氨基酸和蛋白质代谢试验、有机酸盐和胺盐利用试验、呼吸酶类试验、毒性酶类试验等。同样，它也存在一些缺点，例如重现率低、某些技术的不定性、低辨识能力以及相似的表型特征并不等同于相似的或者关系密切的基因型。所以对于许多表型特征难以区别的菌种，通过传统分类鉴定方法就无法准确鉴定到菌种，该方法操作较繁琐，实验周期也较长。

细菌蛋白质组学是蛋白质组学(Proteomics)研究技术在细菌学领域中的应用。细菌蛋白质组的主要研究方法是双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)结合生物质谱分析技术[5]，即通过2-DE 将细菌蛋白质分离，然后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)或表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)对蛋白质进行鉴定，并应用生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析。对细菌蛋白质水平鉴定技术，主要包括免疫诊断技术、蛋白质图谱分析等[6]。

1.2蛋白质水平鉴定

1.2.1 免疫诊断技术

1.2.1.1 免疫诊断技术与抗原抗体反应

免疫学检测技术主要包括二大部分：一是利用抗原抗体之间的特异性结合反应，检测抗原或抗体；二是免疫状态的测定。抗原与相应抗体在体内或体外发生特异性结合反应。应用已知抗体或抗原检测未知抗原或抗体，可以对感染性、非感染性治病因子或疾病相关因子进行诊断或辅助诊断[7]。血清型鉴定就是根据细菌具有相对特异性的抗原结构这个特点进行微生物鉴定的特异方法。抗原的特异性程度存在于属间细菌共有的共同抗原，这种抗原的存在，能表明其属性。另一类特异性抗原只存在于特定的种、型，它是确定细菌种、型的重要依据。通过专门的分型血清即可对这些细菌的血清型进行鉴定。

1.2.1.2 免疫检测常用标记技术

免疫标记技术(immunolabelling technique)是运用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电子致密物质(胶体金、铁蛋白)作为示踪剂标记抗体或抗原进行的一种抗原抗体反应[8]。此类方法具有灵敏、特异、快速，能够定性、定量甚至定位测定，结果易于观察、适合自动化检测等很多优点。广泛用于各种生物活性物质的分析鉴定与定量检测。

1.2.1.3 免疫细胞的检测

细胞因子的分子生物学检测方法：应用细胞因子cDNA探针或寡核苷酸探针，经放射性核素(32P或35S)、生物素或地高辛标记，与细胞因子mRNA或DNA分别进行DNA-RNA杂交(Northern blot)或DNA-DNA杂交(Southern blot)[9]；亦可在组织切片上进行原位杂交分析。其优异性在于特异性高，可避免生物活性检测时其他细胞因子的影响。但是它只能检测细胞因子基因表达的情况，不能直接提供有关因子的含量及生物活性等信息。

1.2.2蛋白质图谱分析

蛋白质图谱分析主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE，Polyacrylamide Gel Electrophoresis)和SDS-PAGE。聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺和N，N，-亚甲双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻长链通过甲叉桥连接形成三维网状结构物质，PAGE根据电荷、形状和分子大小分离和定性、定量分析蛋白质和多肽。SDS-PAGE根据分子量的不同分离蛋白质，SDS是一种阴离子表面活性剂，与蛋白质疏水部分结合使蛋白质带大量负电荷且使蛋白质的形状趋向一致，抵消了蛋白质本身所带电荷和形状的影响，因此，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。采用全细胞SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS -PAGE) 对高度标准条件下培养的细胞的可溶性蛋白质进行分析，可以得到反映生物基因组成的蛋白质图谱信息[10]，这是蛋白质电泳分析用于细菌表型分类及多样性研究的理论基础。这项技术也是一种分群和比较大量相近菌株的较好方法，结果与数值分类和 DNA -DNA 杂交的结果相符合，说明该方法具有一定的可靠性，一般用于属内的分群。

2 细菌数值分类法和自动化鉴定

数值分类法是近20年来发展起来的细菌分类理论，它应用大量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析，根据相似系数大小判断细菌种属间的亲缘性[11], 自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。随着微电子、计算机、分子生物学等先进技术向微生物生学领域的渗透和多学科的交叉，微生物的快速鉴定和自动化分析技术有了突破性的进展，有代表性的是微量多项试验鉴定系统、快速自动化微生物检测仪器。

2.1运用数值分类的自动鉴定系统

1985年，中国引入第一台自动化细菌分析化仪器VITEK-AMS，它以每种细菌的微量生化反应为细菌的鉴定原理。不同种类的VITEK试验卡含有多种的生化反应孔，可达30种。根据试验卡各生化反应孔中的生长变化情况，由读数器按光学扫描原理，定时测定各生化介质中指示剂的显色，或浊度反应，然后把读出信息输入电脑储存并进行分析，再和预定的阈值进行比较。判定反应，再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较，最后将鉴定报告显示出来[12]。

BIOLOG微生物自动分析系统[13]是美国BIOLOG公司从1989年开始推出的一套微生物鉴定系统，该系统主要根据细菌对糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95种C源的利用情况进行鉴定。细菌利用C源进行呼吸时，会将四哇类氧化还原染色剂(TV)从无色还原成紫色，从而在鉴定微平板(96孔板)上形成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”。鉴定板由读数仪自动读取吸光值，软件自动判断结果为阴阳性或边界值，自动与数据库对比，给出鉴定结果。

2.2预测微生物模型自动化鉴定

预测微生物学运用微生物学、工程数学以及统计学进行数学建模,并和应用计算机学相结合组成一门新兴学科[14]，它目的在于用数学的语言描述微生物在不同环境条件下的生长 、死亡情况。这些环境条件包括pH值、水分活度、温度、气体环境等。预测微生物学的核心在于建立完善的数学模型。在微生物的自动化鉴定中，利用美国BIOLOG公司开发的一种新的微生物鉴定方法-代谢指纹法，运用特征选择和优化技术，得到细菌鉴定板上每孔的特征曲线。对于得到的特征-时间曲线，再运用预测微生物学，拟合出预测微生物生长模型[15]，结合统计学原理，对数据进行过滤和匹配，从而实现对细菌的全自动鉴定。

3 化学分类鉴定法

细菌化学分类法通过化学测定，获得细菌基因组和各细菌组分的化学数据[16]，依据得到的化学成分数据在种的水平上对细菌做出精确鉴定。属的分类主要测定各种氨基酸组分。另外，还有全细胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光合色素成分分析等，常使用红外光谱、气相色谱、高效液相色谱和质谱等新技术。

3.1红外光谱

红外光谱法早在20世纪50年代起就开始运用于区分不同的微生物[17]。随着现代干涉型红外光谱仪、傅立叶变换技术以及计算机的发展，这一研究领域又有了新的进展。傅里叶变换红外光谱法以未损伤细胞的傅里叶变换红外光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征，因此可以区分生化信息上的差别。

3.2高效液相色谱法(HPLC)

20世纪60年代末发展起来的一种分离分析新技术[18]，HPLC可直接测定细菌DNA的碱基组成和细菌的化学组分。可在细菌DNA的G+C含量测定、枝菌酸分析、醌类分析。在细菌分类鉴定中的应用，具有分离效率高、选择性好、检测灵敏度高和分析速度快等优点。

4 分子遗传学分类鉴定法

自 20 世纪 60 年代开始，分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学的时代，目前主要的遗传学分析方法，包括DNA(G+C)mol% ，核酸杂交技术，16S rRNA序列分析，MLST(多位点序列分型，Multi Locus Sequence Typing)，全基因组测序，以及核酸指纹图谱等[19]。

4.1DNA(G+C)mol%

染色体DNA的GC含量即DNA的碱基组成[20]，由于不受菌龄的影响，已成为细菌分类鉴定的重要指标。每一种生物的 DNA 均有特定的 G+C mol%，不同生物各不相同，生物种间亲缘关系较近，则 G+C mol% 差别较小，反之亦然。DNA的GC含量测定方法主要有纸层析法、浮力密度法、高效液相色谱法、热变性温度测定法(Tm法)和荧光法等，由于Tm法操作简便、精确度高、重复性好，被广为采用。

4.2核酸杂交技术

核酸杂交技术根据碱基互补配对原理，将2条不同来源的单链核酸进行复性以鉴定菌株间的亲缘关系[21]，用于DNA-DNA(Southern杂交)、DNA-RNA、RNA-RNA(Northern杂交)和PNA-DNA杂交(PNA为肽核酸)。DNA-DNA杂交适用于种水平的研究，而DNA-RNA杂交用于属和属以上水平的分类研究。核酸杂交目前常采用固相杂交法。另外，对线粒体DNA进行杂交分析将对种内和种间的分类更加灵敏。

4.316S rRNA序列分析

16S rRNA广泛存在于原核生物的细胞中，保留了大量的信息量又便于扩增和测序，其基因序列由恒定区和可变区组成，可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，通常利用恒定区序列设计引物，结合 PCR 技术，将 16S rRNA 序列扩增出来，再利用可变区序列的差异来对不同属、种的细菌进行分类鉴定，现已成为大多数微生物实验室的常用方法和描述新的分类单元的必要指标[22]。

4.4MLSA/MLST (多位点序列分析/分型，Multi Locus Sequence Analysis/Typing)

若要鉴定到种水平，需要分辨率很高的基因序列分析，即多位点序列分析/分型[23]。MLST也适合跟踪细菌群体结构的长期变化，尤其是对基因重组率较高的种类进行亚种的分型[24]。由于所用引物并不是在每个菌种中扩增出来，只能小范围应用于某些种，序列相似度的临界值从而难以界定，因此这种方法更适合于分析种内的系统发生关系。MLSA虽然因此而受限，不过作为一项开放性技术，随着数据库的不断扩容，不久的将来会得到更广泛的应用。

4.5全基因组测序

微生物全基因组测序是当前国际生命科学领域中掌握微生物全部遗传信息的最佳途径。目前测序技术有Sanger测序法和焦磷酸测序法2种。Sanger法对基因组测序，精确度较高，但由于焦磷酸法测序速度快，花费低廉，在检测基因突变和SNP(单核苷酸多态性)等需要大量检测短序列的应用中具有不可比拟的优势[25-27]。

5 细菌鉴定方法前景展望

综上所述，传统的分类鉴定需要测定的项目众多，工作程序繁琐，耗时长。免疫诊断技术若无相应抗体则无法鉴定；细菌自动化鉴定适于快速鉴定,但目前国内主要以半自动鉴定设备为主；分子遗传学鉴定是从本质上阐明细菌间的亲缘关系,但所需费用较高，鉴定时间较长。对于不熟悉或从未发表的新菌种，很难采用现有的一种或少数几种方法进行鉴定。因此，细菌分类鉴定必须充分利用和完善现有鉴定技术,使用传统与现代相结合以及不断发掘新的鉴定方法以适应多种微生物的鉴定需要。随着细菌鉴定方法的不断建立和完善,将为科研和临床工作者提供简便、快速、准确、微量、灵敏和成本低廉的检测方法和更先进、更全面的检测手段。

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MethodsofIdentificationofBacteria

Deng Meikui，Sun Ying，Han Wenqing

Medical Information Engineering Institute, School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology( Shanghai, 200093)

The classification and identification of bacteria are equally important compared to its research and application. After bacteria categories are accurately identified, different antibiotic susceptibility lath antibiotic combination, which are specific to bacteria species, such as enteric bacilli, positive coccus, non-fermenter and other bacteria respectively, can be designed to guide clinic drugs application. Currently, methods of bacteria classification and identification mainly include phenotypic and molecular genetic identification. According to these two methods for the classification and identification of bacteria, their physiological and biochemical characteristics were summarized. The key techniques and corresponding merits and defects were systematically elaborated and discussed. Simultaneously, relevant algorithms in numerical taxonomy and automated identification of the phenotypic identification method were studied. Combined with the current method of bacterial identification, this article summarized and prospected the development trend of bacteria identification in the future.

bacteria, classification and identification, automated identification

10.3969/j.issn.1674-1242.2014.02.009

邓梅葵，E-mail:camerrilar@163.com

Q939.1

A

1674-1242(2014)02-0084-05

2014-05-15)