甲病毒载体构建与应用研究进展

郭全海 赵耀光 （商丘职业技术学院动物工程系 河南 商丘 476000）

甲病毒载体是近年研究比较热的一种新型载体，对载体的构建、诱导机体的免疫作用机制、构建高效疫苗等方面研究较多，也取得了很大的成果。甲病毒载体的利用具有良好的前景，但其安全性和存在的问题还有待进一步研究。

甲病毒(Alphavirus)属于披膜病毒科(Togaviridae)，包括辛德毕斯病毒(Sindbis virus, SIN)、西门利克森林病毒(Semliki Frost virus, SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus, VEE)等30个成员[1]。甲病毒可感染众多无脊椎动物和脊椎动物，引起人畜出现发热、皮疹和关节痛等疾病。人们在研究这类由吸血昆虫传播的病毒时，发现该属病毒结构和生活史简单，能在宿主细胞的胞质内大量复制，合成与复制无关的结构蛋白可达细胞总蛋白的25%，并在短时间内诱导细胞凋亡。因此利用甲病毒的这类生物学特性进行改造，构建出相应的甲病毒载体，已被应用于基因治疗和分子生物学研究领域。

1 甲病毒载体的构建

1.1 构建机制 由于病毒结构蛋白和复制酶是由不同的RNA翻译，由亚基因组RNA翻译的结构蛋白并不参与病毒的复制过程，因此缺失了结构蛋白的甲病毒基因组RNA与完整病毒基因组RNA一样，具有感染性、宿主范围广泛、能自我复制以及诱导被感染细胞发生细胞凋亡等特征。研究人员根据甲病毒的这类生物学特性对甲病毒进行了改造，构建出相应甲病毒载体。最初，Davis等[2]在野毒VEEV的基因组cDNA的结构蛋白基因中直接插入外源基因，进行了融合表达。采用这种方式产生的病毒重组子并不稳定，容易产生野生型的病毒粒子，安全性不高。人们提出了由辅助质粒提供复制非必需的结构蛋白基因或者直接缺失病毒结构蛋白基因的策略代替直接在甲病毒基因组中直接外源蛋白基因，提高了甲病毒载体的安全性和稳定性。

1.2 RNA复制子载体 Liljestrom等[3]构建了将病毒结构蛋白基因和非结构蛋白基因分开的SFV表达载体系统，在这一载体系统，非结构蛋白上游为噬菌体SP6或T7聚合酶启动子，病毒的结构基因的编码区被删除但仍含有包装信号(VPs)，以及亚基因组启动子(PSG)。病毒辅助质粒载体含有完整的结构蛋白基因和主要的顺式调控作用元件。这种结构必须在通过SP6或T7 RNA聚合酶启动子在体外对“全基因组”进行转录和加帽，获得5’端含有帽子结构的重组RNA，用于体外表达或免疫动物。这种系统以原核启动子(SP6)启动，表达效率不高，操作也不便。

1.3 DNA-RNA 载体 Diciommo等[4]将RNA复制子系统改建成了以DNA为基础的甲病毒载体，又称DNA-RNA系 统。这种载体为携带了病毒复制酶基因和外源基因的重组质粒DNA，缺失了病毒结构蛋白基因。它通过RNA聚合酶Ⅱ依赖性的表达序列启动自我复制的甲病毒载体的转录。同时在甲病毒本身的终止信号(A69)后插入强转录终止信号SV40poly(A)，使得转录正常终止和RNA的3’末端加上进一步增强其稳定性polyA(A)尾。DNA质粒载体弥补了甲病毒RNA复制子疫苗必须进行体外转录和操作、保存和运输均不便的缺点。

1.4 甲病毒载体诱导机体免疫反应的作用机制 甲病毒载体在宿主细胞中利用细胞内的表达系统表达RNA复制酶，使甲病毒复制子高效复制，并在宿主胞质内大量表达外源基因。Hang等[5]发现由SIN复制子表达的CAT与相应分子结合后被含有TCR／CD3复合物的CD8+T细胞识别，CD8+T细胞进而发挥CTL的杀伤作用。被转染的细胞释放分泌型的抗原，刺激B细胞生成抗体。同时抗原被抗原递呈细胞(APC)摄取，经过一系列的生化反应，促进B细胞的增殖分化，发挥体液免疫作用[6]。用甲病毒载体转染的细胞可激活与甲病毒感染相似的细胞抗病毒防御途径，导致感染细胞的凋亡。Der等发现凋亡的宿主细胞被表面具有αVβ5受体的树突状细胞俘获处理后提呈给CD8+T细胞，可激发强而有力的细胞免疫[7]。

2 甲病毒载体的开发与应用

2.1 构建高效的疫苗载体 由于甲病毒载体的优良作用，现被广泛的用于预防性和治疗性疫苗的研究中。Leitner等[8]用Sindbis、SFV载体与肿瘤相关抗原(TAAs)的模式抗原lacZ构建的复制子免疫小鼠，发现两者均产生了较强的体液免疫和细胞免疫，并能抵抗同源肿瘤细胞的攻击，还能显著延长已建立肿瘤小鼠的存活时间。邓瑶等[9]使用等量的pSFV-SS1和pCDNA3.1-SS1分别转染细胞后发现，前者表达强度是后者的3倍，诱导凋亡的能力是后者的11倍；较低剂量的SFV DNA疫苗可诱生与常规DNA疫苗高剂量组相近的结果。Wolfgang等[10]用携带了自身肿瘤抗原酪氨酸激酶相关蛋白-1的SIN复制子免疫小鼠发现，其可以打破小鼠机体自身的免疫耐受，并使小鼠对黑色素瘤产生免疫。Onate等[11]用携带流产布氏杆菌B.abortus的Cu，Zn 超氧化物歧化酶(SOD)基因的重组的SFV载体腹腔接种的小鼠，能够有力的抵抗B.abortus的攻击。虽然较多的研究表明甲病毒载体疫苗具有较好的免疫效果，但也有反面的报道。张健慧等[12]比较了携带HIV-1 Pr55gag的SFV复制子和传统DNA疫苗在小鼠中的体液免疫原性，发现用0.1和1.0μg的SFV及pcDNA-gag表达质粒肌肉注射小鼠均不能诱导出GAG特异性免疫反应。而分别用载体pSFV及pcDNA-gag表达质粒免疫小鼠，后者诱导的ThⅠ型GAG特异性抗体高于前者，产生这种结果与载体携带的抗原有关。

2.2 构建低致细胞病变型载体 Schlesinger等[13]发现普通的甲病毒载体可在导致宿主细胞在72h内出现凋亡。宿主细胞过早凋亡，使得外源基因不能持续表达，不利于外源蛋白的转运和免疫细胞对其的加工呈递。Weiss等[14]用SINV突变株SIN-1在BHK-21细胞上建立了持续感染，且对细胞的生长影响不大。进一步对这类低致细胞病变株分析表明，非结构蛋白nsP2可能是决定甲病毒致细胞病变能力的关键因素之一[15]。SIN复制子的非结构蛋白nsP2的721位氨基酸由Pro突变为Ser后，能够在BHK-21细胞上建立持续性的感染。携带了β-半乳糖苷酶基因的该SIN突变复制子较普通SIN载体具有更高的蛋白表达能力。将nsP2的721氨基酸由Pro突变为Ser，则会降低SINV基因组RNA的复制能力从而降低致细胞病变的能力；将Pro突变为Leu，进一步降低RNA的合成和SIN复制子的细胞毒性[16]。Lundstrom等[17]将nsP2胞核定位信号结构域的第649位氨基酸由Arg突变为Asp，第259位由Ser突变为Pro，这样的SFV复制子SFV(PD)降低了细胞毒性，并能够在初级海马趾和皮层神经元中增强外源基因的表达。Petrakova等在委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)载体的RNA的5’非翻译区和nsP2、nsP3中引入点突变，发现突变载体能够在BHK-21中建立持续感染，并且其致细胞病变能力低于普通SIN载体[18]。利用低致细胞病变株甲病毒改造成的甲病毒载体，扩大了自身在免疫治疗、细胞发育特殊的信号转导途径等研究上的应用。

2.3 构建温度敏感型载体 Boorsma等[19]在无细胞致病性SFV株的nsP4上引入153号氨基酸(G→F)的突变后，发现携带了毒性蛋白分子基因的SFV载体在29℃时，即可在宿主细胞中获得最大表达，而在37℃检测不到表达活性。Lundstrom等[20]在SFV突变株(PD)的nsP2的713号氨基酸再次引入点突变，可使该低宿主细胞致病型载体在31℃条件下在宿主细胞中存活，并延长外源基因表达达20d以上。这说明甲病毒载体中nsP2、nsP4蛋白裂解结构域的部分氨基酸残基发生点突变，可增强甲病毒载体对温度的敏感性。通过改变温度条件进行甲病毒的筛选可否替代甲病毒载体上携带的抗性基因，从而提高核酸疫苗的安全性值得人们进一步研究。

2.4 构建靶向型疫苗载体 甲病毒载体的宿主范围很广，因此它可以在不同的细胞系中表达外源基因，而利用靶向型甲病毒载体提高甲病毒载体疫苗的作用效率。Ohno等[21]将葡萄球菌蛋白A的IgG结合位点基因，插入到SIN复制子辅助质粒(DH)结构蛋白基因序列中。用这种辅助质粒包装后的复制子对大多数细胞的转染效率降低，却可以靶向结合在添加了IgG单克隆抗体的细胞表面。Tseng 等[22]利用辛德毕斯病毒纤突对细胞表面层粘连蛋白的靶向结合性，仅单次腹膜内注射携带了抗肿瘤基因的SIN载体，即可靶向作用于皮下、胰脏、腹膜和肺脏的大多数的肿瘤细胞，而对正常细胞没有感染能力，同时SIN复制子足以诱导肿瘤的完全退化。Klimstra等[23]将细菌蛋白PpL的4个免疫球蛋白结合结构域基因与SIN的结构基因E2 的N-末端融合，使得用含该融合结构蛋白包装的SIN载体，也具有类似天然PpL与众多哺乳动物抗体IgG的Kappa轻链特异性结合的能力，并且能够靶向的与Fc受体阳性细胞系结合。

3 甲病毒载体存在问题和展望

3.1 存在问题 甲病毒载体虽有许多优点，但仍然存在一些缺陷：（1）转染效率比较低。复制型甲病毒载体质粒一般在12kb左右，较大的分子量使得被转染细胞摄入的核酸量减少，成为可能影响免疫效果的因素之一。（2）甲病毒RNA载体疫苗的不稳定性。RNA容易降解。虽然DNA-RNA系统载体比甲病毒RNA复制子载体更安全、更稳定，但是却不能提供结构蛋白基因，以满足多种甲病毒载体应用的需要，如何增强甲病毒RNA复制子载体的稳定性和易操作性亟待解决。（3）被转染细胞释放外源蛋白病毒样颗粒可能存在困难。甲病毒载体快速诱导细胞凋亡，使得外源蛋白折叠和释放受到影响，从而影响免疫效果。（4）靶向型载体与目标细胞结合的效率低。如何增加靶向型载体的结合效率成为肿瘤和疫病治疗领域研究关注的目标。

3.2 甲病毒载体的展望 改进甲病毒载体的转染方法，提高细胞的摄入率；研制开发有效的甲病毒载体包装细胞系；在甲病毒载体中引入可调节RNA翻译效率和增强mRNA稳定性等顺式调控元件；进一步开发可控制表达和诱导细胞调亡的甲病毒载体；在结构蛋白基因中引入更有效的靶向结合位点将会使甲病毒载体成为功能强大的基因操作工具。

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