椎间盘组织工程支架材料的研究进展

赵经纬，崔冠宇，王 莹，吴成爱，何 达，田 伟

(1北京积水潭医院，北京100035;2北京市创伤骨科研究所)

椎间盘退变是椎间盘退变性疾病(DDD)的病理基础。组织工程技术着眼于利用生物学技术修复或者重建椎间盘生理结构及生物学功能，有望为DDD的治疗提供新的选择。种子细胞、细胞支架、细胞因子是椎间盘组织工程技术的三架马车，细胞支架为细胞生长、增殖提供一个良好的环境，三维立体培养、可注射性细胞培养支架等为椎间盘组织工程技术提供了广阔的空间。本文就椎间盘细胞培养的支架材料研究进展综述如下。

1 椎间盘组织工程支架的种类和特点

Maldonado等［1］于上世纪90年代首先利用藻酸盐微球法成功培养人椎间盘细胞，20余年来，人们发展出多种方法，利用多种支架培养椎间盘细胞。目前，常用的椎间盘组织工程支架可以按来源分为天然材料支架、人工合成材料支架和复合材料支架，也可以按照支架的主要材料成分进行分类。考虑到支架的性能不仅与材料本身相关，还与具体培养步骤有关，故本文在介绍不同材料的同时，对其经典培养步骤进行描述，以供参考。

1.1 藻酸盐 藻酸盐是从褐藻类细胞壁中提取出的一种线性天然高分子阴离子多糖，当其遇到阳离子(Ca2+等)时发生偶联化反应，形成凝胶样物质，具有很好的溶胶—凝胶特性。早期多使用藻酸盐微球的方法。Chelberg等［2］将髓核或纤维环细胞进行原代培养后，将细胞在含1.2%藻酸盐的低黏度生理盐水溶液中重新悬浮起来，制成1×106/mL的悬液，将悬液用23 G注射器在102 mmol/L CaCl2溶液上方滴入，并孵育10 min，形成藻酸盐微球，用生理盐水洗涤3遍，在加入抗生素与5%胎牛血清(FBS)的Ham's F-12培养液中进行最终培养。Melrose等［3］对髓核细胞、移行区细胞及纤维环细胞用类似的方法成功进行了椎间盘细胞培养，并且发现椎间盘细胞在藻酸盐微球培养中可以进行细胞分裂。藻酸盐微球法是目前文献中最为常见的椎间盘细胞培养方法。Renani等［4］比较了藻酸盐微球培养法与壳聚糖凝胶法培养的髓核细胞，发现髓核细胞在藻酸盐微球中增殖的更好。但是Lee等［5］指出该法也存在一定弊端:微球的大小和品质难以统一，使不同研究者结果难以比较;同时，每滴中的细胞数量难以严格控制，增大了实验的不确定性;而区分细胞产生的基质和藻酸盐基质也将变得非常繁琐。

此外，藻酸盐凝胶也可以用于椎间盘细胞的培养。Wang等［6］用藻酸盐凝胶培养骨髓间充质干细胞、髓核细胞、纤维环细胞、软骨终板细胞，并注入兔的椎间盘，再注入CaCl2进行交联。Guillaume等［7］在交联藻酸盐水凝胶的过程中增加一个冻干步骤，使凝胶变成多孔性，在TGF-β3刺激及低糖、低氧条件下培养纤维环细胞，纤维环细胞产生Ⅱ型胶原蛋白以及蛋白聚糖等细胞外基质(ECM)，和纤维环组织结构类似。藻酸盐还可以用来制成纤维支架，或者用藻酸盐纤维交联壳聚糖后进行纤维环细胞的培养。

1.2 壳聚糖 壳聚糖是甲壳素脱乙酰化得到的一种天然高分子阳离子直链多糖，其结构与糖胺聚糖分子结构相似，具有良好的组织相容性。壳聚糖很少单独用于椎间盘细胞培养，多与甘油磷酸、京尼平、羟乙基纤维素交联成复合支架用于椎间盘细胞培养。Mwale 等［8］利用不同浓度(2.5%～10%)、不同种类的壳聚糖(氯化壳聚糖与谷氨酸壳聚糖)与不同浓度的京尼平交联的复合支架培养人椎间盘细胞，发现2.5%的谷氨酸壳聚糖-5%京尼平交联支架最适合培养椎间盘细胞，它在37℃迅速形成凝胶，培养的椎间盘细胞能保留95%活性，并且在注射入小鼠皮下后不引起炎症反应，注入椎间盘裂隙时不会漏出。Roughley等［9］横向比较壳聚糖/京尼平、壳聚糖/甘油磷酸、壳聚糖/甘油磷酸/羟乙基纤维素支架培养牛髓核细胞效果，发现髓核细胞在各支架中均较好维持表型，产生大量蛋白多糖等ECM，且新生基质均能保留在各种支架中，而不随更换的培养液流失。目前，研究提示壳聚糖类支架更适合进行髓核细胞培养，并且能够用来制成温敏型水凝胶进行微创注射移植而具有巨大的潜力。壳聚糖/甘油磷酸制成的温敏型水凝胶支架还可以诱导人类间充质干细胞向人类髓核样细胞分化。

1.3 琼脂糖 琼脂糖是从海藻中提取的线性多糖，是最常用的微生物培养固化剂。琼脂也曾常用于软骨细胞的三维培养。Smith等［10］将牛髓核细胞经过初步培养、传代后，以2.0×107/mL细胞密度植入4%琼脂糖中，并加入细胞因子进行三维培养，所获得的培养组织在功能、成分和分子特性上都与牛髓核组织相近。Iwata等［11］的研究结果表明，利用琼脂糖水凝胶进行犬髓核细胞三维培养时髓核细胞产生硫酸糖胺多糖、透明质酸、Ⅱ型胶原纤维等ECM增加，但是细胞没有增殖;Gruber等［12］的研究结果也表明，琼脂凝胶培养的人椎间盘细胞增殖速度显著低于胶原蛋白海绵培养，目前尚不明确其原因，可能由于琼脂糖培养时产生的ECM较少，从而进一步降低细胞—基质相互作用，降低细胞增殖速度。

1.4 纤维蛋白凝胶 纤维蛋白凝胶是纤维蛋白原经凝血酶激活形成的立体多孔网状结构的聚合物凝胶，具有较高的生物相容性和较低的免疫原性，同时可以释放血小板衍生生长因子和转化生长因子，利于椎间盘细胞的黏附、增殖以及分泌ECM。其培养过程为在牛纤维蛋白原新鲜制备的溶液中加入初步培养、传代过的细胞并打散，取100 μL加入多孔培养小室中，同时加入11 μL灭菌凝血酶溶液，待凝胶凝结后置入孵育箱中［12］。Gruber等［12］利用此法培养的人纤维环细胞高倍镜下呈梭形，周围可见极少量基质，且此法培养的间盘细胞仅表达Ⅰ、Ⅱ型胶原基因，没有表达蛋白多糖及6-硫酸软骨素产生所必须的软骨素-6磺基转移酶，认为纤维蛋白凝胶不适于进行椎间盘细胞培养。Schek等［13］使用京尼平/纤维蛋白交联凝胶培养人纤维环细胞，此时纤维环细胞呈圆形，在京尼平与纤维蛋白比例为0.5的凝胶可以观察到明显的纤维环细胞增殖。

1.5 胶原蛋白 胶原蛋白是椎间盘ECM的主要组成部分，故使用胶原蛋白作为支架能够获得较好的生物相容性和较低的免疫原性。胶原蛋白支架包括胶原蛋白凝胶、胶原/透明质酸支架、胶原蛋白海绵等。

胶原蛋白凝胶:培养时使用纯化的、胃蛋白酶消化的牛皮肤胶原蛋白的盐酸溶液，在胶原蛋白凝结之前将初步培养、传代过的人纤维环细胞分散置入其中，放于多孔培养小室中，置于孵育箱中培养［12］，此法培养的人纤维环细胞高倍镜下呈梭形，周围有少量ECM。

胶原/透明质酸支架:Alini等［14］利用Ⅰ型胶原/透明质酸支架培养牛髓核细胞和纤维环细胞，发现椎间盘细胞能够保留活性，分泌蛋白多糖及Ⅰ、Ⅱ型胶原。但此种支架的主要局限性表现在更换培养液时ECM丢失较多，并且ECM难以均匀散布于支架内部。Calderon等［15］利用Ⅱ型胶原/透明质酸支架培养小鼠间充质干细胞，发现小鼠间充质干细胞在支架中存活良好并向软骨细胞分化。Li等［16］发现用1-乙基-3-(3二甲基氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酼亚胺交联Ⅱ型胶原/透明质酸/6-硫酸软骨素支架后支架的孔隙率以及结合水的能力增加，变性温度提高，具有良好的组织相容性，适用于髓核细胞培养。并且将该支架培养同种异体髓核细胞植入到接受髓核切除术的兔椎间盘内，观察24周发现其椎间盘退变程度明显低于单纯切除术组。

胶原蛋白海绵:Gruber等［17］将人纤维环细胞进行初步培养、传代，置于加有20%FBS的最小需求培养液中。胶原蛋白海绵采用自猪皮肤凝胶颗粒提纯的可吸收胶原海绵，裁成0.5 cm3大小的立方体，每个立方体注入含10万细胞的的上述培养液，将多个胶原蛋白海绵立方置入多孔培养小室，用2 mL 20%FBS液浸湿，放入孵育箱中孵育14 d，其间间断更新培养液。发现纤维环细胞能够保留活性，产生较多ECM成分。

Gruber等［12］使用胶原蛋白海绵、藻酸盐、琼脂、胶原蛋白凝胶、纤维蛋白凝胶等不同支架以及单层培养对人纤维环细胞进行培养，对细胞增殖、分泌ECM和基因表达等方面进行比较，发现胶原蛋白海绵支架中培养的椎间盘细胞能够产生最多的ECM，其次是胶原蛋白凝胶支架，而纤维蛋白凝胶中几乎没有ECM产生。胶原蛋白海绵支架中的细胞数量多，常呈圆形，免疫组化显示细胞旁有大量Ⅱ型胶原产生。另有研究显示，胶原蛋白海绵法细胞增殖速度明显快于大部分其他培养方法，而藻酸盐培养细胞增殖速度最低。胶原蛋白海绵提供了多孔的微环境，使细胞能够产生丰富的ECM。海绵样结构使细胞易于黏附，其多孔性可能使营养物质和代谢废物更易弥散，同时为新生细胞和ECM提供足够的空间。

1.6 去端肽胶原 去端肽胶原是用胃蛋白酶将胶原上的抗原决定簇消化后形成的一种变性胶原，故其抗原性更小，植入时安全性更高。去端肽胶原在4℃时为液态，在37℃时变为凝胶态。根据取材来源不同，去端肽胶原也可制作成与胶原对应的Ⅰ～Ⅳ型。Sakai等［18］利用不同浓度的Ⅰ、Ⅱ型去端肽胶原作为支架培养人髓核细胞，发现去端肽胶原培养的细胞DNA合成显著高于藻酸盐组，低浓度去端肽胶原中细胞合成的蛋白多糖显著高于藻酸盐组。Halloran等［19］利用可注射型Ⅱ型去端肽胶原作为支架培养牛髓核细胞，发现谷氨酰胺转移酶交联的去端肽胶原/透明质酸共聚物能够保留更多的ECM，并且其结构更稳定。Sato等［20］利用高强度膜封的Ⅰ型去端肽胶原蜂巢样支架培养兔纤维环细胞，发现细胞能够维持表形，保留较强的分泌ECM的能力;将支架—细胞复合体同种异体植入兔间盘退变模型中，观察12周，发现细胞增殖和分泌ECM均高于对照组，椎间隙狭窄明显迟于对照组。

1.7 硫酸软骨素 硫酸软骨素是糖胺多糖的一种，是椎间盘ECM的重要组成成分，所以具有较高生物相容性及较低免疫原性。硫酸软骨素不能单独用于椎间盘细胞培养，前面已经提到硫酸软骨素复合支架［16］。Yang 等［21］利用凝胶/6-硫酸软骨素复合支架及凝胶/6-硫酸软骨素/透明质酸复合支架培养人髓核细胞，发现细胞能够分泌 ECM并表达多种ECM相关基因，适用于髓核组织的再生研究。Bhattacharjee等［22］用丝素蛋白交联硫酸软骨素支架动态培养羊软骨细胞，发现培养复合体内部富含Ⅰ型胶原和蛋白多糖，抗压能力强;外周区域富含Ⅱ型胶原，抗拉伸能力强;作者分析该培养复合体模拟椎间盘的结构和功能。

1.8 透明质酸 一种酸性黏多糖，在体内可由纤维母细胞合成，具有良好的组织相容性。Crevensten等［23］将透明质酸凝胶与间充质干细胞混合培养后移植至加压的鼠椎间盘内，1、2周后椎间盘内的间充质干细胞数量明显减少，到4周后间充质干细胞数量明显增加，和空白组对比，合成ECM增加并增加椎间盘高度。这是目前惟一单独使用透明质酸作为支架材料的报道，其余均为利用透明质酸作为一种成分组成椎间盘培养的复合支架［15～18，23］。

1.9 组织脱细胞支架 组织脱细胞支架是通过化学洗涤方法、超声等物理方法结合生物酶等生物方法去除组织中的细胞和抗原成分，保留ECM作为支架材料。Chan等［24］将牛的完整椎间盘(终板到终板)脱细胞后，椎间盘仍然保持其蛋白多糖和胶原的结构以及其生物力学性能，髓核细胞种植到其中的脱细胞髓核组织后细胞存活、增殖良好。Mercurri等［25］通过乙二胺四乙酸等化学洗涤剂、超声和核酸酶去除猪髓核组织中的细胞和猪αGal抗原制成脱细胞髓核凝胶，其生物力学性能和髓核组织相近，用来培养人脂肪干细胞，结果显示人脂肪干细胞在该支架中生存和增殖良好。该支架培养人脂肪干细胞后组织黏弹性增加，细胞表达髓核细胞所表达的基因，植入小鼠皮下没有引起异物反应。

1.10 聚乳酸(PLLA)、聚羟基乙酸(PGA)及其共聚物(PLGA)PLLA、PGA、PLGA是一类人工合成的高分子材料，具有良好的生物相容性，可在体内降解。Mizuno等［26］将PLLA和PGA支架制成纤维环形状，培养羊纤维环细胞，然后在纤维环支架中间空隙处置入藻酸盐—髓核细胞复合物，形成模拟的纤维环—髓核复合体;复合培养1 d后，植入裸鼠皮下，16周后形成大体形态、组织学、生化成分和机械性能均接近天然的间盘组织形态。但有研究表明，这些材料植入体内会产生大量巨细胞持续性反应，这种强烈炎症反应对于后续的体内植入实验不利［13］;Razaq等［27］发现，此类材料体内降解时释放酸性物质引起的pH降低会抑制间盘细胞合成GAG等物质的能力。Vadalà 等［28］利用可释放 TGF-β1的电纺 PLLA 支架培养牛纤维环细胞比普通电纺PLLA支架培养释放更多的蛋白多糖、胶原纤维等ECM。

1.11 聚磷酸钙 聚磷酸钙是一种以磷酸钙/磷酸二氢钙为主要原料通过分子间缩聚反应而生成的一种骨替代材料。Séguin等［29］将牛髓核细胞种植于多孔聚磷酸钙材料表面培养，发现材料表面形成髓核样组织，并且其胶原、蛋白聚糖含量以及生物力学性能与髓核组织相近。Hamilton等［30］通过牛髓核细胞种植于多孔聚磷酸钙材料表面培养，并与体外培养的软骨组织形成髓核/软骨终板/聚磷酸钙的三相结构，探索用于椎间盘置换。但聚磷酸钙脆性较大，降解不易控制，可能限制其应用范围。

除以上较为常用的支架材料，还有部分研究者利用其他支架培养椎间盘细胞，如尼龙纳米纤维支架、多孔丝支架、小肠黏膜下层、光交联的羧甲基纤维素水凝胶等，因使用者较少，本文暂不展开论述。

2 问题与展望

组织工程学研究需要合适的细胞培养支架，要求支架材料具有良好的生物相容性及生物降解性、适当的强度和可塑性、良好的材料—细胞界面、三维立体多孔结构等。椎间盘细胞培养的最佳方法目前仍在不断探索之中。随着材料科学的发展，各种新支架不断被开发出来。在探索新支架材料上，一方面可以将其他器官组织工程正在应用的支架材料拓展到椎间盘细胞培养，另一方面，可在现有材料基础上，进行各种已知材料的混合、交联，如本文中提到的各种壳聚糖交联支架、硫酸软骨素复合支架、在支架材料中加入缓释的细胞因子等，探究新的混合方式与比例，寻找最适合椎间盘细胞培养的复合支架可能是未来发展的重要方向。进行体外组织工程最重要的目的之一是植入体内以实现治疗目的，因此，探究支架植入体内后与机体相互作用具有重要意义。目前，应用支架体外培养细胞的研究较多，而将支架—细胞复合物植入体内的研究相对缺乏，也是未来的研究方向。应用不同支架分别培养纤维环、髓核细胞，在体外构建组织工程人工椎间盘，为今后的组织修复甚至器官置换提供了新的思路。

各种材料横向比较，藻酸盐支架应用时间最长、应用最多;其次为壳聚糖支架，磷酸钙、琼脂、胶原凝胶培养与胶原海绵相比并无优势;单纯的纤维蛋白及透明质酸凝胶不太适用于椎间盘细胞培养，而利用它们构建的复合支架则可以用来培养椎间盘细胞;胶原海绵、去端肽胶原、硫酸软骨素、聚乳酸、聚羟基乙酸、脱细胞支架在椎间盘细胞培养的应用正在不断完善;更多的细胞培养材料不断被开发出来。目前仍需更多实践比较不同支架的优劣与适用范围。可注射性细胞支架是一个很有吸引力的研究方向，因为它可以应用到微创方法治疗椎间盘退变。藻酸盐、壳聚糖支架、胶原蛋白、透明质酸等材料都可以用来制成可注射性细胞支架。

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