液相色谱-串联质谱技术在食品中抗菌药物残留分析中的应用

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(重庆市计量质量检测研究院,国家农副加工产品及调味品质量监督检验中心,重庆市食品安全工程技术研究中心,重庆401123)

液相色谱-串联质谱技术在食品中抗菌药物残留分析中的应用

周纯洁,赵博,朱永红,黄思瑜

(重庆市计量质量检测研究院,国家农副加工产品及调味品质量监督检验中心,重庆市食品安全工程技术研究中心,重庆401123)

对液相色谱-串联质谱技术在食品中常用抗菌药物残留分析中的应用进展进行了综述,重点论述了近年来该技术在几种常用抗菌药物如β-内酰胺类、四环素类、大环内脂类、氨基糖苷类、酰胺醇类、磺胺类、喹诺酮类和硝基呋喃类的残留分析中的应用。同时,介绍了食品中多种类别抗菌药物残留同时检测的液相色谱-串联质谱方法,提出四极杆串联飞行时间质谱在多类别抗菌药物残留同时分析中具有广阔的应用前景,并对液相色谱-串联质谱技术在食品中抗菌药物残留分析领域未来的发展趋势进行了展望。

液相色谱-串联质谱,食品,抗菌药物,检测

在过去的几十年中,各类抗菌药在畜牧生产中的应用显著增加,由此导致的动物源性食品中抗菌药物残留问题变得日益突出,严重危害人类健康,因此迫切需要发展简便、快速、灵敏、准确的残留分析技术来控制抗菌药物在食品中的残留问题。由于抗菌药物通常沸点较高、难挥发并且对热不稳定,限制了各类检测技术在其残留分析方面的广泛应用。针对抗菌药物残留问题常用的分析方法主要有免疫分析法和液相色谱法。免疫分析法操作简便、检测成本低且灵敏度较高,可以对某些具有相似结构的药物进行同时测定,因此常作为一种初筛方法。但由于该法是以抗原-抗体反应为基础,所以无法区分同类药物,并且定性和定量准确性较差。而常规的色谱技术由于灵敏度较低及选择性差等原因,也难以满足痕量抗菌药物残留定性和定量分析的要求[1]。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)是近年来在食品安全检测领域得到迅速发展的一类新型分离分析技术。其中,三重四极杆串联质谱(QqQ)因其高灵敏度和高选择性的优点,应用尤为广泛。QqQ将两个四极杆质量分析器进行串联,可通过选择性扫描,有效地降低背景噪音的干扰,从而在很大程度上提高了检测的灵敏度,正好可以作为痕量抗菌药物残留检测的理想分析方法。

1 LC-MS/MS在单一类别抗菌药物残留检测中的应用

1.1 β-内酰胺类

β-内酰胺类(β-Lactams)是指分子结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素,是目前应用最为广泛的治疗动物细菌感染的抗菌药物,分为青霉素和头孢菌素两大类[2]。孙雷等[3]建立了动物源性食品中13种青霉素和头孢菌素类抗生素残留检测的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)方法。样品经乙腈-水溶液提取,正己烷脱脂,C18固相萃取柱净化并浓缩后,经C18色谱柱分离,正离子模式多反应监测,检出限1ng/g,回收率79%～99%。陈锦凤[4]比较研究了动物肌肉组织中青霉素多组分残留的液相色谱-三重四极杆串联质谱(LC-QqQ)和液相色谱-飞行时间质谱(LC-ToF)检测方法,提出ToF在精密度、检出限以及回收率方面均不如QqQ。

1.2四环素类

四环素类(Tetracyclines)是由放线菌产生的具有氢化并四苯环结构的一类广谱抗生素。由于其抗菌谱较广且价格低廉,目前仍广泛应用于畜禽养殖业中疾病的治疗以及用作促生长剂。四环素类抗生素分子结构中具有两个易与金属离子螯合的酮羰基,大大影响样品前处理时的提取效率。因此,在进行四环素类药物残留分析时常在提取溶剂中添加螯合剂(如草酸和EDTA盐)。刘蓉蓉等[5]建立了蜂蜜中4种四环素类抗生素(土霉素、四环素、金霉素、强力霉素)及其3种差向异构体(差向四环素、差向土霉素、差向金霉素)的LC-ESI-MS/MS检测方法。样品经EDTA-Mcllvaine缓冲液提取,HLB及羧酸弱阳离子固相萃取柱净化后进行测定,在10～500μg/kg添加范围内线性良好,回收率64.9%～91.0%,相对标准偏差(RSD)小于10.5%,方法定量准确,重现性好。

1.3大环内酯类

大环内酯类(Macrolides)是一类具有十二元、十四元或十六元内酯环配糖体的抗生素。这类抗生素具有亲脂性,因此常用的有机溶剂(如乙腈、氯仿、二氯甲烷)均可将其从样品基质中提取出来。Wang等[6]比较研究了鸡蛋、生鲜乳及蜂蜜中6种大环内酯类抗生素残留的液相色谱-三重四极杆串联质谱(LC-QqQ)和液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱(LC-QToF)检测方法。样品经乙腈或者磷酸盐缓冲液(pH8.0)提取,固相萃取柱净化后进行测定,QToF的全扫描模式可以得到这几种大环内酯类药物的精确质量数,同时鉴别其降解产物；而QqQ的多反应监测模式在灵敏度和重复性方面具有更大的优势。郭春海等[7]建立了测定牛奶和奶粉中吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素和泰乐菌素残留的LC-ESI-MS/MS方法,采用乙腈提取目标物,HLB固相萃取柱净化,检出限1～8μg/kg,回收率81.5%～96.1%,该法回收率高,重现性好。

1.4氨基糖苷类

氨基糖苷类(Aminoglycosides)是一类由氧桥连接氨基糖与氨基环醇而成的苷类抗生素,是从链霉菌或者小单孢菌中提取,以天然品为原料合成或半合成制得的,包括链霉素、卡那霉素、安普霉素、妥布霉素、庆大霉素和新霉素等。氨基糖苷类分子结构中多个极性基团的存在使得这类抗生素极性很强,在C18色谱柱上保留很弱,因而在进行液相色谱分离时需要在流动相中加入离子对试剂七氟丁酸(HFBA)或五氟丙酸(PFPA)。Zhu等[8]研究了不同食品基质中13种氨基糖苷类抗生素残留的LC-ESI-MS/MS检测方法。样品经5%三氯乙酸溶液提取,HLB固相萃取柱净化后测定。由于其中7种氨基糖苷类抗生素在pH<1时保留较好,而另外6种在pH8.5时保留较好,净化时将两种不同pH的HLB固相萃取柱串接可同时净化这13种药物。龚强等[9]研究了乳制品中10种氨基糖苷类抗生素残留的LC-ESI-MS/MS检测方法,样品提取液通过HLB固相萃取柱净化后测定,方法定量限10～20μg/kg,回收率71.2%～101.7%,该法操作简便且灵敏度较高。

1.5酰胺醇类

酰胺醇类(Amphenicols)是指一类具有酰胺醇结构的抗生素的总称,包括氯霉素、甲砜霉素等,是一类广谱抗生素。酰胺醇类抗生素在食品中的残留会对人类的健康构成直接或潜在的威胁,特别是氯霉素具有抑制造血机能的毒副作用,导致人类再生障碍性贫血,许多国家已严格禁止将氯霉素用于食用动物养殖业中。我国于2002年起禁止在食用动物的所有用途中使用氯霉素。陈小霞等[10]建立了鸡肉组织中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留的LC-ESI-MS/MS检测方法。样品经乙酸乙酯提取,正己烷脱脂,浓缩后定容直接测定,检出限为0.010μg/kg,线性范围0.050～1.00μg/kg,加标回收率69.0%～92.8%,该方法通过简单的液液萃取过程提取净化,具有操作简便、测定周期短等优点。巩军等[11]研究了乳及乳制品中氯霉素残留的UPLC-ESI-MS/MS检测方法,方法检出限0.05～0.1μg/kg,回收率75.0%～94.6%。

1.6磺胺类

磺胺类药物(Sulfonamides)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类化学合成抗菌药物,能够抑制细菌的叶酸代谢,干扰细菌核酸和蛋白质的合成。自2005年起,我国农业部将畜产品中磺胺类药物残留情况作为继盐酸克伦特罗(瘦肉精)之后的又一个重点监控对象。Sergi等[12]研究了肉制品中13种磺胺类药物残留的LC-ESI-MS/MS检测方法。该方法采用基质固相分散萃取(MSPD)提取和净化样品,并选择0℃的甲醇作为提取溶剂,有效地降低了提取液中脂肪及蛋白质含量。郭伟等[13]建立了牛乳中24种磺胺类药物的UPLC-ESI-MS/MS分析方法,样品采用经改良的分散固相萃取(QuEChERS)技术提取和净化,方法检出限为0.21～1.62μg/kg,回收率在64.2%～110.9%之间。赵笑天等[14]研究了猪肉和鸡蛋中12种磺胺类药物的UPLC-ESI-MS/MS检测方法。样品经超声波辅助萃取后,通过磺胺类药物免疫亲和净化柱净化并浓缩后进行测定,检出限达1.0～5.0μg/kg。

1.7喹诺酮类

喹诺酮类(Quinolones)是近几十年迅速发展起来的具有4-吡啶酮-3-羧酸功能基团的一类合成抗菌药物,主要有恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星等,具有高效、低毒、抗菌谱广等优点,因此被广泛应用于畜牧和水产养殖业中。饶勇等[15]研究了同时测定牛奶中10种喹诺酮类抗菌药物的LC-APCI-MS/MS方法。样品经三氯乙酸提取,乙腈沉淀蛋白,聚合物反相Strata-X固相萃取柱净化后测定,大气压化学电离(APCI)-离子肼(IT)质谱定性及定量测定,回收率60.6%～101.0%,检出限0.2～0.8ng/mL。Karbiwnyk等[16]报道了测定虾中3种喹诺酮类抗菌药物残留的液相色谱-荧光检测(LC-FL)以及LC-ESI-ITMSn方法。样品经乙酸乙酯提取后,使用0.2%甲酸溶液进行溶剂交换,正己烷脱脂后测定,MS3子离子谱图中丰度最大的3个离子作为对应3种喹诺酮类药物的确证离子。倪永付等[17]建立了检测猪肉中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星残留的微波辅助萃取-LC-ESI-MS/MS方法。样品经微波辅助萃取后,正己烷脱脂,无水Na2SO4除水,浓缩后进行测定,定量限为10μg/kg,回收率在88%～101%之间。

1.8硝基呋喃类

硝基呋喃类(Nitrofurans)也是通过化学合成得到的一类广谱抗菌药物。由于硝基呋喃类药物在体内代谢迅速,而其代谢产物也有致畸、致突变、致癌作用,因此测定时通常监测其代谢物的残留量[18]。目前研究较多的主要是呋喃唑酮代谢物(AOZ)、呋喃它酮代谢物(AMOZ)、呋喃西林代谢物(SEM)以及呋喃妥因代谢物(AHD)。这些硝基呋喃代谢物分子易与细胞膜蛋白结合,在弱酸性条件下才能释放出来,且分子量普遍较小,背景干扰大,使得检测灵敏度降低,因此实际检测过程中通常采用2-硝基苯甲醛在酸性条件下先进行衍生化反应,得到具有较好质谱特性的芳香亚胺类化合物之后再测定。Rodziewicz[19]研究了牛奶中4种硝基呋喃代谢物的LC-ESI-MS/MS检测方法,在酸性条件下把与蛋白结合的硝基呋喃代谢物解离,与2-硝基苯甲醛进行衍生化反应,然后直接液液萃取提取净化浓缩后测定。张平安等[20]建立了蜂蜜中硝基呋喃代谢物残留的LC-ESI-MS/MS检测方法,外标法定量即可得到83.5%～96.1%的回收率,检出限为0.5μg/kg。

2 LC-MS/MS在多类别抗菌药物残留同时检测中的应用

与单一类别药物同时检测相比,多类别抗菌药物同时检测(Multi-Class Residue Analysis)的方法不仅可以提高检测效率,缩短检测周期,节省成本,还能大幅度地扩大检测覆盖面。随着超高效液相色谱(UPLC)的迅速发展,LC-MS/MS技术在多类别抗菌药物残留同时检测领域的应用近年来受到越来越多的关注[21]。Chico等[22]建立了同时检测鸡肉中5类(四环素类、喹诺酮类、青霉素类、磺胺类和大环内酯类)39种抗菌药物残留的UPLC-ESI-MS/MS方法。样品经含EDTA的甲醇-水(V∶V，70∶30)溶液提取并稀释后直接测定。Vidal等[23]建立了同时测定蜂蜜中包括大环内酯类、四环素类、喹诺酮类和磺胺类在内的4类17种抗菌药物残留的UPLC-ESI-MS/MS检测方法。样品经Na2EDTA溶液溶解,HLB固相萃取柱净化后测定,正离子模式多反应监测,定量限小于4μg/kg。郭黎明等[24]建立了鸡肝中3种四环素类、10种磺胺类和8种喹诺酮类药物残留同时检测的UPLC-ESI-MS/MS方法。样品经Mcllvaine缓冲液-乙腈提取后氮气吹干,磷酸三乙胺缓冲液-乙腈复溶,正己烷脱脂后进行测定,方法检出限为2μg/kg,回收率66.8%～128.5%。侯建波等[25]报道了测定蜂蜜中包括磺胺类、硝基咪唑类、喹诺酮类、大环内酯类、林可酰胺类和吡喹酮在内6类54种药物残留同时检测的LC-ESI-MS/MS方法。样品经磷酸盐缓冲液(pH8)稀释,HLB固相萃取柱净化后进行测定,正离子模式多反应监测,定量限在0.3～3.0μg/kg之间。郭德华等[26]研究了测定猪肉、猪肝、虾、牛奶和鸡蛋中6类76种兽药残留的LC-ESI-MS/MS方法。该方法将包括磺胺类、硝基咪唑类和苯并咪唑类在内的43种抗菌药物与其它3类兽药同时进行检测,进一步提高了兽药残留检测的分析通量。

四极杆串联飞行时间质谱(QToF)是近年来发展起来的一类新型串联质谱技术,能够采集高质量准确度和高分辨率的全扫描谱图,从而得到化合物的精确质量数信息,单位时间扫描的化合物没有数量限制,因此其在食品中多类别抗菌药物残留同时检测领域的应用也逐渐受到了的人们的关注[27]。Zheng等[28]研究了牛奶、鸡蛋、鸡肉和鱼肉中7种喹诺酮类抗菌药物的LC-ESI-QToF检测方法。样品提取液经在线固相微萃取净化后进行测定,检出限在0.2～3.0μg/L之间,回收率80%～115%。张洁等[29]利用UPLC-ESI-QToF结合数据库研究了乳制品中包括磺胺类、青霉素类、四环素类、大环内酯类在内的4类19种抗生素的分析方法。样品经乙腈和酸化乙腈分步处理,冷冻离心后进行测定,正离子模式下扫描,在10min内完成了19种抗生素的分离和检测,检出限3～5μg/L,平均回收率在68.4%～96.7%之间。

3 展望

LC-MS/MS作为一种具有高选择性和高灵敏度、定性定量准确的检测技术,在抗菌药物残留分析中具有突出的优势。目前针对抗菌药物残留检测的方法标准主要还是按照单一类别同时检测的分析方法,不同类别的抗菌药的前处理方法和检测条件各不相同,成为抗菌药物残留检测发展的一个瓶颈。结合各类抗菌药物的理化性质和LC-MS/MS高选择性高灵敏度的优势,扩展分析通量,发展多类抗菌药物残留同时检测的技术可以有效缩短检测周期,已成为该领域发展的趋势。随着各种新型串联质谱技术(如QToF)的发展和不断完善,LC-MS/MS在多类别抗菌药物残留同时检测领域的应用必将更加广泛,为建立简便、快速、灵敏、准确的抗菌药物残留检测方法提供技术支持。

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Recent applications of liquid chromatography tandem mass spectrometry for analyzing antimicrobials residue in food

ZHOUChun-jie,ZHAOBo,ZHUYong-hong,HUANGSi-yu

(Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection,National Center of Quality Supervision& Inspection on Agricultural Processed Products and Condiments,Chongqing Engineering Research Center for Food Safety,Chongqing 401123,China)

Recent applications of liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)in the area of residue analysis of antimicrobials in food were summarized. The main attention in this review was focused on the recent advances of LC-MS/MS in detecting the most widely used classes of antimicrobials,such as β-lactams,tetracyclines,macrolides,aminoglycosides,amphenicols,sulfonamides,quinolones and nitrofurans. Meanwhile,multi-class antimicrobials residue analysis in a single procedure by means of LC-MS/MS was also stated,with the quadrupole in tandem with time-of-flight mass spectrometry system as an ideal tool. At last,the development trends of applications of LC-MS/MS for analyzing antimicrobials residue in food were proposed.

LC-MS/MS;food;antimicrobials;detection

2013-06-25

周纯洁(1985-)，女，博士，工程师，研究方向：食品安全检测。

重庆市食品安全检测关键技术研究及示范(cstc 2012gg-yyjs80028)。

TS207.3

：A

：1002-0306(2014)01-0367-04