乳腺肿瘤微钙化与纳米细菌的关系

李 涛 潘晓燕 陈海鸣 张 伟

纳米细菌(nanobacteria,NB)是目前已知的最小的有细胞壁的细菌,它通过产生磷灰石结晶使体内多种细胞发生病理性钙化[1]。多项研究发现纳米细菌与多种恶性肿瘤的钙化有密切的关系[2-3],但尚未有明确研究报道乳腺癌微钙化与纳米细菌的关系。为此，我们采用ELASA法和免疫组化法研究纳米细菌和乳腺癌微钙化的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集上海市闸北区市北医院和南昌大学第一附属医院2011年6月-2012年6月的乳腺疾病手术患者共110例，均为女性。依据良恶性及有无钙化分为4组：A组为恶性伴钙化组，30例，平均年龄55.6岁。B组：恶性无钙化组，30例，平均年龄52.2岁。C组：良性伴钙化，20例，平均年龄37.5岁。D组：良性无钙化，30例，平均年龄31.2岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 分别采集上述患者的血清及病灶组织标本。

1.2.2 主要试剂 鼠抗纳米细菌单克隆抗体8D10(10 μg/ml) 购自芬兰Nanobac OY 公司,ELASA Kit 购自KPL公司，生物素化羊抗鼠IgG、ABC试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司。

1.2.3 血清纳米细菌感染的检测 ELASA法：①将血清标本于-70 ℃解冻,取50～100 μl按1∶4用抗原包被液稀释。②取100 μl包被液至各孔，4 ℃ 18～24 h或37 ℃孵育4 h，洗涤液洗3次，每次3 min(阳性对照按1∶25稀释，每次设一阴性对照)。③加入封闭液每孔200 μl，37 ℃孵育1 h，洗涤液洗3次，每次3 min。④各孔加入鼠抗纳米细菌单克隆抗体100 μl，37 ℃孵育1 h，洗涤液洗3次，每次3 min。⑤各孔加入羊抗小鼠IgG 100 μl，37 ℃孵育1 h，洗涤液洗3次，每次3 min，最后一遍浸泡5 min。⑥每孔加入100 μl底物复合液，37 ℃避光显色至满意，5～15 min后加入终止液50 μl，在20 min内用酶标仪自动测定结果，波长405 nm。判断标准：以测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均吸收值的比值大于2判断为阳性。

1.2.4 组织纳米细菌的检测 免疫组化染色检测，SABC法。判断标准：在高倍视野下可见细胞质内或细胞外微小的棕黄色颗粒者为纳米细菌感染的组织或细胞或纳米细菌本身。

1.3 统计学方法

实验数据用SPSS11.0软件分析，采用χ2检验。检验水准为α=0.05 。

2 结果

2.1 各组患者血清中纳米细菌感染率

患者血清中纳米细菌感染率A组73.3%(22/30)，B组10.0%(3/30)，C组5.0%(1/20)，D组6.7%(2/30)。A组与其他各组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，B、C、D组组间比较，差异均无统计学意义。

2.2 各组患者组织中纳米细菌感染率

患者组织中纳米细菌感染率A组93.3%(28/30)，B组13.3%(4/30)，C组5.0%(1/20)，D组0.0%(0/30)。A组与其他各组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，B组与C、D组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，C、D组组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

乳腺组织的钙化是很常见的。在乳腺癌当中，伴有微钙化的占40%～50%，良性疾病的钙化也有约20%[4]。乳腺良恶性钙化的成分和分布是不同的，恶性钙化几乎都为羟磷灰石，且肿瘤坏死区域最多。良性钙化主要为草酸钙，且多数不伴坏死，而草酸钙只能由活性细胞分泌。本组资料也发现NB主要分布于恶性肿瘤的坏死区域，包括B组4例NB阳性的标本均是伴有明显坏死。而良性的2组均不伴坏死。这些证据提示良恶性乳腺肿瘤钙化的形成机制可能不同。

NB的1个重要特性就是它通过产生磷灰石结晶使体内多种细胞发生病理性钙化。目前的许多研究已证实它与多种钙化性疾病密切相关，如泌尿系结石，胆道结石，动脉硬化等，并且与卵巢恶性肿瘤的砂粒体形成有关[2-3，5-6]。国内唐中华等通过电镜观察20例乳腺癌标本，其中19例观察到了纳米细菌样颗粒的存在[7]。本研究A组血清及组织中NB的感染率均明显高于其他组，说明NB与乳腺癌钙化有密切的关系。提示NB感染可能与乳腺癌微钙化的形成有关，而与良性钙化的形成无关。而恶性无钙化组的感染率高于良性组我们认为可能是部分感染的病例是早期尚未形成钙化灶。

对于乳腺癌微钙化形成的具体机制目前尚不完全清楚，现有的主要观点包括：①组织坏死或营养不良；②肿瘤细胞的分泌；③钙泵或钙调蛋白的功能失调；④坏死组织或细胞碎片的矿化等。这些观点相互之间难以连贯。Ciftcioglu等研究发现许多恶性肿瘤都存在NB黏附受体，可以介导NB的进入，并且导致随后肿瘤的钙化，这一理论经von Kossa染色证实[8]。NB的感染如果是乳腺癌微钙化的关键因素，则有可能将上述的观点很好的串联起来：乳腺癌肿瘤细胞是否也会表达NB的粘附分子从而介导NB的进入，进而导致细胞钙代谢失调，进一步造成组织坏死及微钙化的形成。这一假设尚需进一步研究证实，但这为解释乳腺癌微钙化的形成机制提供了1个新的切入点。

对于某些早期无肿块的乳腺癌，微钙化往往是唯一的阳性发现。因此，微钙化对于乳腺癌的早期诊断非常有意义。但判断钙化的良恶性是比较困难的。早先研究认为钙化的大小，数目及分布有助于鉴别良恶性，这一观点也被广泛接受。但较近的多项研究发现上述的某些特征对于鉴别钙化的良恶性意义不大，钙化灶活检不到30%的恶性检出率也支持这些观点[9-10]。本组资料显示，恶性钙化组伴有NB感染的比例明显增高，特别是血清检测感染的比例明显增高，而且血清ELASA检测简便易行。因此，将NB血清感染作为1个辅助参考指标来明确钙化的性质理论上是可行的。如果进一步的研究能获得证实，将有助于提高判断钙化良恶性的正确性，从而避免许多患者接受不必要的活检。本组数据除A组外各组的血清NB感染率均低于国外报道14%的健康人群的感染率；B组血清感染率略高于国内报道的健康人群8%的感染率，C、D两组则稍低。可能与良恶性两组的平均年龄相差较大有关，国内外的资料均提示随着年龄的增加，NB感染的比例也会增高[11]。

文献报道伴有钙化的乳腺癌侵袭性强，淋巴结转移的发生明显高于无钙化的病例，预后相对较差[12]。张家云等也报道伴钙化的乳腺癌患者合并HER-2阳性的比例明显增加，病程多较晚[13]。这些均提示钙化的形成可能与肿瘤的恶性程度及病程发展相关。Cooke等的研究显示羟磷酸盐不仅能刺激细胞的有丝分裂，加快肿瘤细胞的生长，而且能诱导癌细胞穿透基膜而发生转移[14]。钙代谢异常可能是伴钙化乳腺癌预后差的原因。NB是否在伴钙化的乳腺癌的发展过程中扮演了重要的角色是个值得研究的方向，并且也可能为乳腺癌的治疗提供了1个新的靶点。

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