稀脉萍对水中甲基橙的毒害响应及去除研究

陈秋平，胥思勤

（贵州大学喀斯特环境与地质灾害防治教育部重点实验室，贵州 贵阳 550003）

稀脉萍对水中甲基橙的毒害响应及去除研究

陈秋平，胥思勤

（贵州大学喀斯特环境与地质灾害防治教育部重点实验室，贵州 贵阳 550003）

用甲基橙作为胁迫因子，研究了甲基橙对稀脉萍叶片过氧化物酶活性、可溶性蛋白含量和叶绿素含量的影响，并采用稀脉萍去除甲基橙。结果表明：随着甲基橙浓度的增加，过氧化物酶活性呈先上升后下降的趋势，当甲基橙浓度为140mg／L时，过氧化物酶活性达到最高值。当甲基橙浓度 ＞100mg／L，可溶性蛋白含量急速下降。叶绿素含量和叶绿素 a／b比值均随甲基橙浓度的升高而降低。当甲基橙浓度为20mg／L时，稀脉萍对甲基橙的去除需经10d的延滞期，24 d后去除率达89.6%。

甲基橙；稀脉萍；毒性；去除；研究

浮萍科植物 （以下简称浮萍）作为小型的水生单子叶植物，在植物毒性评价试验中具有很多优势［1］，这不仅是由浮萍本身生物学特点所决定的，也是由长久以来利用浮萍作为生态毒理学研究的模式材料，积累了大量有关的生态毒理学信息所决定的［2］。浮萍能分解、吸收、转化氮和磷以及有机物等营养物质，具有优越的生长性能和广泛的用途，因此采用浮萍处理污水已成为环境领域的研究热点之一［3］。

稀脉萍，又称稀脉浮萍，叶状体自由漂浮在水表面，2～8个连在一起形成群体，主要进行营养繁殖，在实验室中培养时1—4d即可翻番，是我国分布最广、最常见的浮萍属种类［2］。

甲基橙是一种互变异构体，在酸性和碱性条件下的偶氮和醌式结构是染料化合物的主体结构，因此以其作为染料模型化合物具有一定的代表性［4］。尹红霞等［5］采用电化学催化氧化法降解水中甲基橙，Wen等［6］采用纳米二氧化钛光催化降解甲基橙，王晓燕等［7］利用海绵铁还原耦合活性炭吸附－微波再生技术降解甲基橙。稀脉萍对水中甲基橙的毒害响应及去除研究尚未见报道。本文以过氧化物酶活性、可溶性蛋白质含量、叶绿素含量等为指标，研究稀脉萍对甲基橙的毒理学响应，探讨稀脉萍去除水中甲基橙废水的可能性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：UV－3200PCS紫外可见分光光度计；Sartorius电子天平；PYX－250s－B生化培养箱；Sartorius PB－10酸度计；SHA－B恒温振荡器；TGL－16G台式离心机；CS101－33EB型电热鼓风烘干箱。

试剂：甲 基橙 （上海 试 剂 三 厂 生产），K2HPO4、MgSO4、KNO3、Ca（NO3）2、80%丙酮、愈创木酚、30%H2O2、Na2CO3、NaOH、CuSO4· 5H2O、酒石酸钾钠、钨酸钠、钼酸钠、磷酸、硫酸锂。以上药品均为分析纯。

1.2 稀脉萍的采集与培养

从九龙江附近鱼塘采集稀脉萍 （Lemna aequinoctialis），选择个体健壮、叶片完好的植株用自来水冲洗3遍，置于加有 Hoagland培养液的搪瓷盘中预培养7d，培养温度为25℃，光强4000lx，光照时间12h。隔天向盘内添加 Hoagland培养液以保持液面高度。培养后的浮萍作为实验材料。

1.3 方法

1.3.1 甲基橙对稀脉萍的损伤

（1）实验设计

以 Hoagland培养液为稀释液，配制甲基橙浓度分别为 0、20、40、60、80、100、120、140、160、180mg／L的溶液作为培养液。毒性实验在150ml烧杯中进行，实验期间不更换培养液，在生化培养箱中 （培养温度 25℃，光强4000lx，光照时间12h）培养72h，每个浓度重复3次，每个重复稀脉萍的初始植物体数为60。

（2）酶液的制备

实验结束时，随机选择一定数量的稀脉萍叶片，洗净、吸干水分并称重，加入预冷的3ml 0.05 mol／L磷酸盐缓冲液 （pH＝7.5），在冰浴中匀浆，匀浆液移入10ml离心管中，用缓冲液清洗匀浆器，将清洗液并入离心管，定容至5ml，在4000r／min离心10min，取上清液于4℃下保存备用。

（3）过氧化物酶活性 （POD）测定

取光径1cm比色皿2个，于一个中加入2.4ml反应混合液［8］和0.6ml磷酸盐缓冲液作参比；另一个中加入2.4ml反应混合液和 0.6ml上述酶液，立即开启秒表计时，于470nm处测量吸光度，每隔1min读一次吸光度，每份样品测 3min，计算 POD活性。

式中：N0－POD活性，U／g；A470－3－3 min时470 nm处吸光度；A470－0－470 nm处初始吸光度；t－时间，min；G－稀脉萍叶片鲜重，g。

（4）可溶性蛋白含量的测定

采用Folin酚法［8］测定可溶性蛋白含量。以牛血清白蛋白为标准蛋白，在620nm处测定。

样品中蛋白含量 （mg／g）＝C×VT／（V×W× 1000）

式中：C－查标准曲线值，μg；VT－提取液总体积，ml；V－测定时加样量，ml；W－稀脉萍叶片鲜重，g。

（5）叶绿素含量测定

将剩余的稀脉萍洗净、吸干水分并称重，加入少量的 CaCO3粉末和 80%丙酮进行研磨，充分匀浆。匀浆液移入 10ml离心管，用80%丙酮洗涤匀浆器，清洗液并入离心管，定容至5ml，4℃放置24 h后，4000r／min离心 10min，以80%丙酮为参比，取上清液于645nm、663nm处测定吸光度。

按公式①、②、③［9］计算叶绿素 a、b和总浓度：

式中：Ca－叶绿素 a的浓度，mg／L；Cb－叶绿素b的 浓 度，mg／L；C总－叶 绿 素 总 浓 度，mg／L。

按公式④计算叶绿素的含量：

式中：C总－叶绿素浓度，mg／L；V－提取液总体积，ml；A－取样鲜重，g。

1.3.2 稀脉萍对甲基橙的去除

挑选生长健壮、叶片完好、长势相同的植物体，先用蒸馏水冲洗（不损伤根系）、风干 （5～10min）、称重，放入直径25cm、高20cm的塑料盆中，每盆加入初始浓度为 20 mg／L的甲基橙废水5L，同时设置对照组，用不透光的黑纸覆盖，覆盖面积与稀脉萍覆盖面积相同。对所有塑料盆的外侧也用黑纸遮盖，使之与天然水体光照情况接近。考虑到水的自然蒸发和浮萍的蒸腾作用，试验在每次测定培养液中甲基橙残留浓度时称水量，这样可以避免水的添加致使污染物被人为稀释，使植物的吸收行为可能发生变化。通过称水量，换算所观测指标的总量来计算去除率，使本试验的去除效果与自然状态更为符合。甲基橙的测定方法参照文献［5，10］。去除率的计算公式为：

式中：C0－培养液中甲基橙的初始浓度；V0－培养液的初始体积；Ci－第 i天培养液中甲基橙的残留浓度；Vi－第 i天培养液的体积。

2 结果与讨论

2.1 甲基橙对稀脉萍的损伤

2.1.1 POD活性

三组平行实验，结果取平均值分析。甲基橙对稀脉萍POD活性的影响见图1。从图1可见，随甲基橙浓度的增加，POD活性总体上呈先上升后下降的趋势，且最高浓度组的 POD活性仍高于对照组。当甲基橙浓度为140 mg／L，POD活性出现最高值。

POD是植物适应多种逆境胁迫的重要保护酶之一，在一定的污染浓度范围内，酶活性得以维持或提高，超过这个范围，活性下降［11］。由于甲基橙的存在，导致稀脉萍通过一系列生理生化反应产生了对自身有害的过氧化物，随着这种物质的增加，POD利用 H2O2来催化这些对自身有害的过氧化物的氧化分解，因此，随植物体内这些POD底物浓度的增加，致使 POD活性上升。而当处理浓度进一步增加，有毒有害物质超过 POD正常的催化能力后，导致其活性下降。许多研究还表明，POD－H2O2分解系统参与了叶绿素的降解［12］，并且POD活性与叶绿素含量呈高度负相关［13］。本实验中，随着甲基橙浓度的增加，POD活性逐渐增加，叶绿素含量减少 （图3），叶绿素a／b值减小，这也说明甲基橙通过 POD活性增加直接或间接地影响叶绿素的降解。

2.1.2 可溶性蛋白含量

随着甲基橙浓度的增大，可溶性蛋白含量呈下降趋势 （见图 2），特别是甲基橙浓度 ＞100 mg／L之后呈急速下降的趋势。当甲基橙浓度为180mg／L，处理3d后稀脉萍可溶性蛋白含量降到最低，比对照组降低了44.7%。由此可见，甲基橙污染可引起可溶性蛋白持续下降，可能是甲基橙引起蛋白变性，也可能是酶蛋白失活或DNA翻译转录途径受阻，影响了蛋白质的合成。甲基橙污染在抑制新蛋白质合成的同时，也可能加强了原有蛋白质的分解。

2.1.3 叶绿素含量及叶绿素 a／b值

稀脉萍叶片中叶绿素a（Chl.a）、叶绿素 b （Chl.b）和叶绿素总量 ［Chl.（a＋b）］均随甲基橙浓度的升高而降低（见图3）。当甲基橙浓度为180 mg／L，处理3d后 Chl.a、Chl.b和Chl.（a＋b）均降到最低，分别比对照组降低了60.3%、33.3%和50.5%。叶绿素 a／b值总体上随甲基橙浓度的增加而逐渐减小（见图4）。

叶绿素是植物进行光合作用的色素，叶绿素含量和组分是影响光合作用的物质基础，叶绿素含量低，光合作用弱，会导致植物鲜重降低，使植物不能正常新陈代谢［11］。叶绿素含量减少是衡量叶片衰老重要的生理指标［14］。Woolhouse［15］认为随着叶片的衰老，叶绿素含量逐渐下降，叶绿素a比叶绿素b下降得更快，叶绿素 a／b比值可作为叶片衰老的指标。在本研究中，叶绿素含量及叶绿素a／b比值随着甲基橙浓度的增加而减少，这说明甲基橙能加速稀脉萍叶片老化。

2.2 稀脉萍对甲基橙的去除

利用浮萍治理受污染水体有很多其他治理方法无法比拟的优点，所以无论是在废水的处理上还是在水体的生态恢复上，利用浮萍来处理受污染水体已引起人们的关注［16，17］。在上述毒性试验的基础上，选取甲基橙初始浓度为20 mg／L来探讨稀脉萍对甲基橙的去除情况，实验结果见图5。由图 5可见，稀脉萍对甲基橙的去除需要经过 10d的延滞期，然后进入加速去除阶段，18d、20d和 24d的去除率分别达40%、55.2%和89.6%。10d的延滞期可能是稀脉萍对甲基橙水溶液的适应期，但显然，可以采用稀脉萍来去除甲基橙。关于温度、光照、pH值等环境条件对稀脉萍去除甲基橙的影响以及稀脉萍去除甲基橙的机理，有待于进一步研究。

3 结论

（1）随着甲基橙浓度的增加，稀脉萍叶片的POD活性总体上呈先上升后下降的趋势，可溶性蛋白含量呈下降趋势，叶绿素 a、叶绿素 b、叶绿素总量、a／b值均呈下降趋势。

（2）稀脉萍对甲基橙的去除需要经过 10 d的延滞期，24 d后去除率达89.6%。

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Study on Toxic Response of Lemna Aequinoctialis to Methyl Orange and Removal of Methyl Orange

CHEN Qiu－ping，XU Si－qin
（Key Laboratory of Karst Environment and Geohazard Prevention，Ministry of Education，Guizhou University，Guiyang Guizhou 550003 China）

Methyl orange was used as an environmental stress factor to examine the effects on enzyme activity of peroxidase，content of soluble protein，and chlorophyll content of Lemna aequinoctialis leaves.L.aequinoctialis was applied to removal Methyl orange.The results showed that enzyme activity of peroxidase rised first and then fell with the increase of Methyl orange concentration.When Methyl orange concentration was 140 mg／L，enzyme activity of peroxidase came to the maximum.When Methyl orange concentration was more than 100 mg／L，soluble protein content dropped rapidly.The chlorophyll content and the ratio of chlorophyll a to chlorophyll b decreased with the increase of Methyl orange concentration.When Methyl orange concentration was 20 mg／L，there was a 10－day lag period.Then the degradation rate of Methyl orange could reach 89.6%after L.aequinoctialis was cultured 24 days.

Methyl orange；Lemna aequinoctialis；toxicity；removal；study

X131.2

A

1673－9655（2014）04－0059－04

2014－02－28

陈秋平 （1986－），男，硕士研究生，主要从事环境工程方面研究。

胥思勤，女，副教授，博士后，硕士生导师。