疫苗佐剂的研究进展

李丹 陈阳 刘宇 王爽 王岩 秦明伟 史同瑞

（黑龙江省兽医科学研究所 黑龙江 齐齐哈尔 161000）（哈尔滨铁路兽医卫生处 哈尔滨 150006）

佐剂最早来源于拉丁语“adjuvare”一词，为“帮助”，是指能够提高机体对抗原的适应性免疫应答的物质，能够在免疫反应中诱导全面持久的免疫应答。在疫苗制剂中，佐剂的功能主要包括：增强疫苗抗原的免疫原性；促进细胞免疫和体液免疫，优化免疫应答，促进免疫能力较弱人群中的免疫应答；增进抗原与黏膜之间的传递以及免疫接触；减少疫苗成分中抗原的需求量以及在实施过程中的免疫接种次数；优化抗原结构，维持抗原构象等。

从巴斯德至今近百年来已开发了许多菌苗和疫苗，但传统的疫苗一般多为全菌或全病毒制成,其中含有大量非免疫原性物质，这些物质除具有毒副作用外也有佐剂作用，所以一般不需要外加佐剂。因此，很长一段时间以来主要是研究毒素、类毒素、抗毒素的学者在研究和使用佐剂。直到1925年，法国免疫学家兼兽医学家Gaston Ramon发现如果在白喉和破伤风疫苗中加入某些与之无关的物质可以特异地增强机体的抵抗反应，从此佐剂引起了人们的注意，许多国家也开始不同程度的开展了这方面的研究。

1.传统佐剂

1.1 铝佐剂

铝佐剂是目前兽用疫苗和人用疫苗上应用最广泛的佐剂。铝佐剂苗可以分为铝沉淀疫苗和铝吸附疫苗两种，铝沉淀疫苗是将铝剂悬液加至抗原液中，铝吸附疫苗是将抗原溶液加至氢氧化铝或磷酸铝中。两种铝佐剂疫苗不仅能够减少抗原用量，还能够增强机体的免疫应答。铝佐剂通常用氢氧化铝，其次是明矾及磷酸三钙。

1926 年，Glenny发现用明矾沉淀的白喉类毒素悬液要比类毒素本身具有更高的抗原性，免疫豚鼠取得了较强的免疫效果。1931年，Glenny等又报道了氢氧化铝吸附抗原制成的疫苗在注射部位具有缓慢释放的功能，就此提出氢氧化铝佐剂的作用机制为储存库效应。然而在1950年，Holteta首次对此机制提出质疑。长期以来关于铝佐剂疫苗的具体机制尚不明确，但目前Glenny理论是对于铝佐剂作用机制的主流解释。随着科学的发展和研究水平的提高，人们对于氢氧化铝的作用机制不断有了新的认识。

2004 年Rimanilo等研究发现氢氧化铝佐剂可激活固有免疫应答。2007年Li等研究发现，巨噬细胞主要对抗原进行吞噬和破碎作用，铝则激活细胞内源性免疫应答相关的Nalp3炎性复合体，促进巨噬细胞分泌产生高水平的促炎症因子IL-1β 和IL-18。Eisenbart等进一步研究证实氢氧化铝佐剂还可激活T2细胞分泌IL-4，诱导MHC-Ⅱ类分子和CD83、CD86等的表达，诱导Th2型体液免疫应答。2013年周洋证实铝佐剂可升高血浆中促炎细胞因子和趋化因子水平。

Skeda等报道Alum的佐剂性是由吸附介导的，因此，Alum的佐剂性取决于铝盐对抗原的吸附程度。Alum对蛋白抗原的吸附还与静电吸附和疏水性的相互作用有关。带有阴电荷的重组疟疾疫苗，与带有阳电荷的Alum能很好结合，而与带阴电荷的磷酸铝则很难结合。另外，结合位点数目也是影响吸附的重要因素，在大分子中结合位点数目与分子量成正比。

虽然铝佐剂是被FDA批准可用于人类疫苗的佐剂，其安全性和有效性得到了人们的公认，但铝佐剂也有许多不足之处，如因其不能冻干，所以有些新型疫苗无法适用；当铝佐剂通过皮下或皮肤内注射而不是肌肉内注射的路径时通可产生肉芽肿；而且在许多情况下铝盐并不是一个好的佐剂，尤其是在诱导细胞免疫应答上，其可诱导产生体液免疫应答，但不能诱导产生细胞免疫应答，同时可诱导产生IgE 抗体产生，发生变态反应，增加发生超敏反应的危险。

1.2 油佐剂

此类佐剂在动物实验中大量使用，一般包括水包油（O/W）或者油包水乳剂（W/O）和水包油包水双相乳剂（W/O/W）。如是弗氏佐剂（FA），又可分为弗氏不完全佐剂（FIA）和弗氏完全佐剂（FCA），MF59，AS03，AF03和SE等。

弗氏佐剂（FA）是用矿物油（石蜡油）、乳化剂（羊毛脂）和灭活的分枝杆菌（结核分枝杆菌或卡介苗）组成的油包水乳化佐剂。这三种成分俱全的佐剂称为福氏完全佐剂（Freund’s Complete Adjuvant,FCA），不含分枝杆菌的佐剂为福氏不完全佐剂（Freund’s Incomplete Adjuvant,FIA）。FIA是典型的只诱导Th2型细胞因子，诱生抗体的佐剂。FCA因其中含有灭活的分枝杆菌（长介菌）成份，是标准的诱生体液和细胞免疫佐剂，可诱导Th1型细胞因子，能够促进IgG的产生，抑制IgM的产生，从而抑制免疫耐受的产生，推迟超敏反应，增加移植排斥，促进抗肿瘤作用。石蜡油因不能代谢而存留在注射的部位，这就阻碍了抗原降解或快速反应，起到抗原储存作用，使抗原缓慢持续的释放，不断刺激机体的免疫系统而产生免疫反应。

但因为矿物油不能被代谢，所以会产生一系列的副作用，矿物油乳剂常见的副作用有注射部位的炎症反应、肉芽肿、溃疡等，另外矿物油以及其中的组分如姥鲛烷、正十六烷等还会引起佐剂型关节炎等自身免疫反应。对于人类常规的预防性疫苗来说乳剂的毒性太大，一般只是用于科学研究或癌症患者。

随着乳化技术的进步，可选择代谢油取代初期的矿物油来制备更为安全、稳定、有效的免疫佐剂，如MF59、AS03、AF03和SE等，MF59是目前研究较热门的佐剂之一。MF59由角鲨烯（角鲨烯是一种较石蜡油更易代谢的植物油）、Tween-80和Span-85等组成，既可以刺激机体产生体液免疫也可以产生细胞免疫。MF59是除铝佐剂外首个用于人类的新型佐剂，它能增强老年人群中流感的免疫原性，于1997年在欧洲获得认证作为流感疫苗的佐剂。AS03与MF59类似，在欧洲认证用于流感疫苗，并在2009年H1N1流感大流行中得到广泛使用。

2.新型佐剂

2.1 细胞因子类佐剂

细胞因子多属小分子多肽或糖蛋白，相对分子质量在15 000～35 000之间，由活化的免疫细胞和相关细胞产生的，能影响其他细胞功能，对免疫应答、炎症反应有介导和调节作用，是一类通过与高亲和力的特异性受体相互作用，可在低浓度下发挥作用的生物活性物质。目前已有多种细胞因子如IL-12、IL-15、IL-18、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和干扰素γ（IFN-γ）等作为病毒D N A 疫苗佐剂在实践中得到应用，并有效增强了D N A疫苗的特异性免疫反应。这类物质可与抗原共表达而发挥佐剂作用，提高核酸疫苗的免疫保护率，或组装成表达质粒，与抗原混合使用。

通过多年的研究，人们逐步对各种不同的细胞因子佐剂刺激机体产生的不同作用有了一个大致了解，细胞因子通过免疫调节提高抗原提呈能力，诱导并增强C T L 的作用；细胞因子佐剂能使机体持续产生抗体，并阻碍淋巴滤泡中生发中心的形成；细胞因子能将B 细胞与外周隔绝，使抗体生成下降，从而起到阴性免疫调节作用。

过去人们普遍认为IL-12是佐剂效果最好的细胞因子，研究发现IL-12抑制肿瘤细胞作用很强，并显著增强了CTL活性，同时增加内源性IFN-γ 的分泌。最近IL-7和IL-15作为关键细胞因子被应用来增强CD8T细胞的免疫记忆。在DNA疫苗同编码IL-15的基因联合投递增强免疫应答来对抗小鼠布氏杆菌感染的实验中，小鼠接种此疫苗增强了体液免疫，布氏杆菌病特异性抗体IgG 2α 的量超过了IgG1，脾脏细胞内IL-15佐剂DNA疫苗诱导更高水平的IFN和CD8T细胞，同时对诱导CD4T细胞也有贡献。

细胞因子在DNA疫苗应用中有特殊的潜力，细胞因子可以和抗原在同一载体里共表达。但因其分泌有可能增加诱导IgE产生，引起过敏反应，增加疫苗的不良反应。

2.2 CpG ODN佐剂

CpG是指由胞嘧啶、鸟嘌呤及使两者相连的磷酸酯键组成的二核苷酸，CpG二核苷酸及其5，端和3，端的各两个碱基构成CpG基序。人们发现细菌DNA具有较强的抗肿瘤作用，这种抗肿瘤作用是基于细菌DNA的强大免疫刺激功能，而这与其所含的非甲基化的CpG基序有关，因此CpG基序也被称为免疫刺激序列，它是细菌DNA产生免疫刺激作用的核心结构。

目前以CpG ODN为佐剂的细菌类疫苗的研究涉及：炭疽杆菌疫苗、伤寒疫苗、白百破疫苗、流感嗜血杆菌疫苗、霍乱疫苗等。以CpG ODN为佐剂的病毒类疫苗的研究涉及：流感病毒疫苗、呼吸道合胞病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、单纯疱疹病毒疫苗、生殖器疱疹病毒疫苗等。以CpG ODN为佐剂的寄生虫类疫苗的研究涉及：曼森血吸虫病疫苗、疟疾疫苗、利什曼病疫苗、鼠弓形虫疫苗等。

虽然CpG ODN具有安全有效等优点，但还是有许多问题有待于解决：比如它的免疫激活机制、免疫剂量（高剂量CpG ODN及重复给药可能导致毒性效应）和最适免疫途径还需要进一步研究。目前CPG作为人用乙肝疫苗已进入临床试验。

2.3 脂质体佐剂

脂质体是由磷脂和固醇类组成的双层脂质分子小球，能够包裹抗原，其表面为疏水结构，内部为亲水结构。脂质体既可做抗原载体又可做佐剂，用它包裹D N A 疫苗到达靶细胞后,脂质体与靶细胞融合并将DNA释放入细胞进行表达。巨噬细胞等吞噬了含有抗原的脂质体，经溶酶体酶消化释放抗原，可激活T 细胞及B 细胞。脂质体的佐剂效力依赖于脂质双分子层的数量、电荷、组成成份以及制备的方法。

脂质体能显著增强机体对抗原的免疫应答，包括产生保护性抗体和细胞免疫应答，还可以作为载体与其它佐剂（如脂质A、胞壁酰二肽及其衍生物、IL-1、IL-2等）或DNA疫苗联合使用，刺激巨噬细胞分泌TNF-α、IF-γ、IL-6和IL-12,诱导CD8+细胞毒性T 细胞为主的免疫应答，同时增强APC的递呈能力，从而增强机体免疫应答。

但作为疫苗佐剂脂质体也存在一些不足：稳定性较差，磷脂中的不饱和脂肪酸储存时会逐渐氧化，小脂质体倾向于相互融合成大脂质体，在融合过程中可以导致包入抗原的释放。此外，佐剂与不同的抗原合用，其非特异性免疫调节作用是不可预知的，此外免疫途径，抗原用量对特定脂质体疫苗免疫原性也有极大影响，所以单纯脂质体作为佐剂的作用机理不可能得到全面的诠释。同时脂质体在制备过程中要求一定的技术性，其费用也比其他免疫佐剂高，目前对脂质体的应用研究还主要集中在医学研究方面，在兽医疫苗研究中的应用前景还具有一定的不确定因素。

2.4 免疫刺激复合物（immunostinulating complex ISCOM）

ISCOM由皂角苷、胆固醇、磷脂以及抗原的磷酸盐溶液组成。粒径小于40nm，通过前3个组份之间的疏水作用而结合在一起，疏水的或亲水的抗原均可以结合到其复合物上。主要通过增强APC的内吞作用，诱导黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答，产生持久的抗体滴度和保护性应答，可通过肠道外和黏膜途径免疫。它适用于诱导细胞免疫反应的疫苗，正在临床研究中的有流感病毒疫苗、人乳头瘤病毒疫苗。

因ISCOM产生有效免疫所需的抗原很少，使其有可能成为多价亚单位疫苗的有效佐剂。ISCOM具有佐剂和抗原提呈的双重功能，既可激发细胞介导的免疫反应，又可刺激体液免疫。临床研究表明，ISCOM是目前诱导T淋巴细胞系（CTL）反应最强的免疫刺激物。

3.结语

合理选择和使用佐剂不但可以节约抗原的使用量，还可以迅速刺激免疫系统，增强免疫应答。对佐剂的研究一直是疫苗研究过程中的重要环节，理想的佐剂应该是广谱、无副作用、对免疫系统具备有效的激活作用，同时便于生产和使用。但是在佐剂大量出现的同时，随之而来的是对其安全性的担忧。因此，未来的工作重点之一应是深入研究佐剂的作用机制，全面推测其对免疫系统的影响，寻找并建立合理可靠的动物模型，预测免疫毒性发生的可能性。