转基因棉花抗逆性研究进展

2014-04-03朱彦卓代文俊任燕萍

湖南农业科学 2014年15期

刘超，朱彦卓，代文俊，任燕萍

（新疆农业大学农学院，新疆乌鲁木齐830052）

棉花作为我国主要的经济作物，在国民经济中占有很重要的地位。随着人们生活水平的不断提高，对棉产品的需求也日趋增加。利用现代分子育种技术提高棉花抗逆性是解决棉花抗逆育种的有效途径。虽然转基因棉花技术在我国研究起步较晚，但已经取得了较大的进展。国内相关转基因棉花的研究以往多侧重于抗旱棉以及转Bt基因的抗虫棉等方面，对其它基因的报道相对较少。现将转基因棉花抗逆性研究进展综述如下。

1 转基因棉花的抗旱性

随着全球温室效应的不断加剧，干旱问题日益突出，严重影响了作物的产量和品质。在我国西北地区，水资源缺乏的问题更为明显。因此，研究抗旱的转基因棉花对提高棉花产量和减少灌溉次数有重大意义。

吕素莲[1]的研究表明，转betA基因的棉花的抗早性显著增强，不仅是因为甜菜碱在干旱条件下保护细胞膜的稳定性和完整性，而且积累的甜菜碱可使转基因棉花的渗透调节能力得到提高。更有意义的是，在盛花期经过干早处理后，4号转基因株系的单株产量显著高于对照植株。

转基因棉花蕾期抗旱性验证试验结果表明，过量表达TsVP基因提高了转基因棉花干旱处理下蕾期的适应能力。在干旱处理后，转基因植株能够维持较低的细胞溶质势，可能是由于细胞内积累了更多的细胞溶质如糖、氨基酸等，从而更好地维持细胞渗透压，避免干早胁迫造成的伤害。

曹燕燕等[2]的研究结果表明，转rolB基因不仅显著提高转基因棉花的茎粗，而且明显增强了其生根能力，与野生型植株的根冠比存在显著差异，抗旱性更强。王娟[3]对棉花各个生长阶段抗旱性进行了检测，结果表明转外源ZmPIS基因不仅提高了转基因棉花苗期、蕾期和盛花期的抗旱性，而且在开花期进行长期干旱处理后，转基因株系中同样培育出单株产量显著高于对照组的株系。

为了得到聚合多个抗旱基因的棉花植株，通过有性杂交将betA基因与TsVP基因聚合到同一棉花植株中。结果表明，在转聚合基因棉花植株中，betA基因与TsVP基因的表达都得到验证，并通过各自不同的抗旱机制发挥生物学功能，与转单个基因的棉花植株相比，进一步提高了棉花在干旱条件下的适应能力，为培育抗旱棉花新品种提供了新材料。吴伟[4]在前人研究的基础上，将ZmPLC1基因和betA基因聚合在同一植株中，在转基因棉花的苗期、蕾期和花期进行干旱处理，也证明了聚合表达可以进一步提高棉花的抗旱性。这也表明了通过基因聚合手段提高植物抗逆性是可行的。杨云尧[5]的研究也说明了转MvP5CS和转MvNHX1基因棉花在干旱胁迫下相对于野生型植株有更强的抗旱性；分析田间农艺性状的数据表明，两种转抗逆基因的棉花株系在干旱处理和正常条件下各项指标差异不显著，而野生型棉花各项数据均比其在正常培养条件下要低，说明转抗逆基因的棉花植株在一定程度上提高了植株对逆境的适应性。蔡永智[6]对转CBF1和KatG基因棉花的高代材料进行干旱处理，结果表明转基因棉花在各项光合参数、生理指标和农艺性状调查方面相对于对照组均表现出了较强的适应能力。这说明转CBF1和KatG基因棉花能提高植株的抗旱性，进而提高了棉花的产量。因此，通过转基因技术提高棉花抗旱性将是棉花抵抗干旱和减少灌溉次数的有效手段。

2 转基因棉花的抗虫性

早在1986年，美国Agracetus公司利用农杆菌介导法，首次将苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）基因导入棉花，获得稳定遗传的抗虫性，就开创了抗虫棉花的新纪元。随着谢道听等[7]转Bt基因棉花的成功培育，使我国成为世界上第二个拥有转基因抗虫棉技术的国家。1992年，郭三堆等[8]又通过添加增强转录水平基因的方式，改造BtCryIA杀虫晶体蛋白基因结构，筛选出了抗虫能力更强的抗虫棉。另外，美国孟山都公司将豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI）转入陆地棉品种，在室内进行生物活性测定，结果表明该转基因棉花对棉铃虫和棉象虫具有很好的抗性。陈志贤等[9]成功将CpTI基因利用农杆菌介导法导入棉花中，随后通过构建双价表达载体获得了转Bt+CpTI双价基因的棉花新品种。

张宝红[10]的研究表明，除了Bt基因和CpTI基因被应用于棉花抗虫基因工程外，糖分代谢过程中α-淀粉酶的抑制基因和抑制昆虫神经系统的蝎毒素、促进昆虫蜕皮的脱皮激素等基因，都可整合进植物基因组，达到增强植株抗虫性的目的。郭金英[11]认为转Bt+Sck双价基因棉花在三个不同的生长发育阶段都对棉铃幼虫有较好的抗性，但不同生育期对棉铃虫的抗性有所不同，苗期抗虫性最强，其次是盛花期，即使到铃期转基因棉花的抗虫能力仍然很强。

3 转基因棉花的耐盐性

与其它作物相比，棉花本身具有一定的耐盐性，并且因品种和生育期不同，其耐盐能力存在差异。棉花苗期对盐敏感程度最强，而且许多研究表明部分棉花品种的耐盐能力在不同生长期与苗期的抵抗盐胁迫的能力的是相对应的。

孙小芳等[12]测定了13个棉花品种在不同盐浓度胁迫下的相对萌发率、苗期相对叶面积和株高等指标，结果表明不同棉花品种的耐盐性与生长阶段相对应；苏棉8号和10号的耐盐性前期低于后期；而中棉所19号生育前期的耐盐性明显强于后期；另外，泗棉2号和苏棉12号整个生育期耐盐能力较弱。这些结果对于筛选耐盐棉花品种具有指导意义。

吕素莲将盐芥TsVP基因转入棉花中，也显著提高了转基因棉花在苗期的耐盐能力。经盐处理过表达TsVP基因，促使Na+进入液泡，从而削弱了细胞质中过量Na+积累对细胞膜乃至整个细胞的伤害。

张慧军等[13]以泗棉3号棉花的下胚轴为材料，将山菠菜AhCMO基因利用农杆菌介导法转入其基因组中，盐胁迫试验结果表明转AhCMO基因的棉花耐盐性显著优于对照组棉株，说明AhCMO基因提高了转基因棉花对盐胁迫的耐受性。

连丽君[14]的研究表明，经250mM的NaCl处理，转betA基因的棉花种子出苗率优于对照；250mMNaCl胁迫处理21 d后，非转基因对照组的植株叶片失水过快，相对含水量从80.79%下降到48.54%，而转基因植株则表现出较好的抗性，作为渗透保护物质的可溶性糖、游离氨基酸等的含量均高于非转基因对照植株；胁迫后转基因植株的叶片相对电导率和丙二醛含量都较非转基因对照植株低，这表明转基因植株的细胞膜损伤和膜脂过氧化的程度较轻；另外，转基因植株的光合作用系统受到盐胁迫的影响也较轻，其净光合速率、气孔导度和蒸腾速率都明显高于非转基因对照。在单株籽棉产量方面，转基因植株也远远高于非转基因对照植株。

谢得意等[15]设计不同浓度的NaCl处理棉花种子，结果表明NaCl浓度低于0.4%时，可促进棉花种子萌发；但NaCl浓度超过0.7%时，棉花种子萌发受到抑制；而NaCl浓度低于0.5%的胁迫处理对棉花苗期的子叶面积、主根长、子叶含水量等影响都低于对照。

樊文菊[16]的研究表明，转ZmPLC1基因棉花可正调控脯氨酸合成关键酶（P5CS）基因，负调控脯氨酸降解关键酶（ProDH）基因，使胞内脯氨酸的含量增加，有利于细胞渗透压的调节。除此之外，还通过与Ca2+调节的抗氧化防御系统的共同作用，维持细胞正常光合作用，提高转基因棉花的抗盐能力。

植物的耐盐性受多条代谢途径的多个基因调控，而转单一基因仅能在一定程度上提高植物的耐盐性。因此，可以尝试将多个耐盐相关基因通过基因聚合的方式导入到同一个植物中，可能对植物的耐盐性会有更大程度地提高。

4 转基因棉花的抗寒性

大量研究表明，棉花对低温非常敏感，特别在西北内陆棉区，低温直接影响棉花的产量。因此，提高棉花的抗寒性是提高西北内陆棉区产量的有效途径。

连丽君的研究表明，在15℃培养条件下，转betA基因棉花种子的出苗率与非转基因对照存在显著差异；经5℃冷胁迫处理24 h，非转基因棉花叶片的相对含水量明显比转基因棉花下降快，而转基因棉花的相对电导率明显低于非转基因对照植株。这表明低温胁迫对转基因棉花叶片细胞膜的损伤程度低，提高了棉花的抗寒性。酶活性测定结果表明，转基因棉花的SOD酶活性显著高于非转基因棉花，体内自由基的清除能力较强，可保护细胞避免过度氧化。低温条件下转基因棉花的胞间CO2浓度、气孔导度、净光合速率和蒸腾速率与非转基因棉花存在显著差异，转基因棉花与非转基因棉花相比，其参与光合作用的元件低温损伤较轻。

陈亮亮[17]将昆虫抗冻蛋白基因Mpafp149通过花粉管通道法导入北疆棉区主栽品种中，经过低温处理，转Mpafp149基因的棉花植株受低温伤害的程度较轻，其叶片的丙二醛含量和相对离子渗漏率均小于非转基因棉花，说明转基因植株在冷胁迫后质膜的伤害程度较轻，提高了棉花的抗寒性。

随着转基因棉花抗寒性的提高，棉花的播种时间也可以适当提前，在霜冻来临之前完成生活史，避免因低温造成的棉花减产。

5 转基因棉花的抗除草剂特性

在棉花的生长过程中往往存在杂草竞争，在营养、光照、水分和空间等资源有限的情况下，杂草竞争将直接影响棉花的产量和品质。因此，为了减少杂草的危害，人们逐渐在棉花生长过程中适当使用除草剂。

早在上世纪70年代，欧洲千里光（Senecio vulgaris）对均一三氮苯除草剂就具有抗性，随后在许多杂草和微生物体内都发现了低抗除草剂的基因，因此选育出抗除草剂的棉花新品系对除草剂的使用具有重要意义[18]。

刘东军等[19]在对草甘膦处理的棉花品系Y18的抗性研究中发现了两个不同的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因EPSPS l和EPSPS2。李燕[20]将EPSPS基因转入陆地棉当中，以3～6 g/L的除草剂进行筛选，获得了两个抗草甘膦株系S06-1和S06-2。除此之外，来源于土壤潮湿霉菌的Bar基因，通过编码膦丝菌素乙酰转移酶（PAT），可以把草丁膦的自由氨基乙酰化，最终表现出对草丁膦的抗性。杨沛艳[21]通过除草剂抗性试验，确定了大田棉花的草甘膦筛选浓度为0.4%；当草甘膦浓度提高到0.8%时，对照棉花枯萎死亡；当草甘膦浓度高达1.0%时，转基因植株枯萎死亡。

对抗除草剂转基因棉花的研究结果表明，选择合适的除草剂及喷施浓度，可以综合提高劳动生产效率和棉花产量。

6 转基因棉花的抗病性

早在20世纪80年代我国多位科学家联手合作将萝卜抗真菌蛋白基因（Rs-6）、β-1，3-葡聚糖酶基因（Glu）、几丁质酶基因（Chi）等导入我国棉花的主栽品种中，筛选出一系列抗黄萎病和抗枯萎病的棉花株系。李莉等[22]将木霉几丁质酶基因（TvChi）利用花粉管通道法导入4个新疆陆地棉品种（系）中，并通过病圃抗病性检测，在T2代植株中选育了30株具较高抗黄萎病能力的棉花。程红梅等[23]同样利用花粉管通道法将几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因导入棉花，经鉴定后在温室和病圃中进行多代抗性筛选，成功培育出抗枯萎黄萎的转基因棉品种（系）。王义琴等[24]将天麻抗真菌蛋白基因（GAFP）利用花粉管通道法导入新疆彩色棉品种中，通过分子鉴定和田间抗性筛选，获得了高抗黄萎病的转基因棉花。黄骏麒等[25]将52-128的DNA片段导入两个高感材料江苏棉1号和江苏棉3号中，获得2个高抗品系3072（苏1+52-128）和3049（苏3+52-128），其后代表现出株高高于受体，结铃数近似供体，生育期缩短、发病率下降的特性。石河子大学生物技术中心将菜豆几丁酶和β-1，3-葡聚糖酶基因导入棉花，成功培育出18个抗病、抗虫的转基因棉花和1个高抗黄萎病品系（94-56）[26]。蔡应繁等[27]首次采用基因枪法和叶盘法将抗真菌的β-1，3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因转入棉花基因组中，获得了抗真菌基因的转基因棉花。乐锦华等[28]成功构建菜豆几丁质酶基因（BChi）与烟草β-1，3-葡聚糖酶基因（Nt-Glu）双价植物表达载体pBLGC，并利用花粉管通道法导入新疆棉花主栽品种（系）中，通过分子检测，并进行病圃枯萎病抗病筛选，获得抗病性突出和遗传性稳定的转基因棉花。雷江荣[29]从分子生物学鉴定、致病菌接菌鉴定、病程相关蛋白表达、防御酶系分析和组织结构抗性分析等多个角度对T1代转基因棉株进行枯萎病抗性分析，结果均证明棉花转入snc1基因后能够有效的提高棉株对棉花枯萎病的抗性，为棉花抗病机理研究做了有益探索。

7 展望

近年来，虽然棉花抗逆基因工程的发展迅速，但仍然面临着一些问题，例如：对抗逆分子机制缺乏足够的了解，导致转基因育种存在盲目性；有利性状基因聚合的相关研究较少，而采用单一基因转化，不同品种间的表达存在差异；利用过表达启动子（35S）驱动抗逆基因高水平表达时有可能造成畸形植株的产生；外源基因转化方法和体系的建立还有待进一步完善等。因此，今后有关转基因棉花抗逆性的研究可以从以下方面开展：（1）筛选培育出重要农艺性状的棉花群体，开展棉花遗传分子图谱的研究；（2）通过突变体技术，建立棉花突变库，结合生物信息学，研究棉花抗逆相关基因的表达方式和调控机制，从而阐明其分子机制；（3）建立和优化遗传转化体系及方法，提高转基因棉花的转化效率；（4）将诱导型启动子和特异性表达的启动子有效组合，实现外源基因表达的精确调控，避免组成型启动子带来的负面影响；（5）对转基因棉花进行有效地评价，可以提高转基因棉花抗逆品种培育的效率和效果。

[1]吕素莲.转betA和TsVP基因提高棉花耐盐、抗旱性的研究[D].济南：山东大学博士学位论文，2007.

[2]曹燕燕，廖平安，葛昌斌，等.转rolB基因棉花抗旱性研究[J].湖南农业科学，2012，（15）：1-2，5.

[3]王娟.转ZmPIS基因及聚合betA/TsVP基因提高棉花耐旱性的研究[D].济南：山东大学硕士学位论文，2010.

[4]吴伟.转ZmPLCI-betA基因棉花的耐旱性研究[D].济南：山东大学硕士学位论文，2012.

[5]杨云尧.转MVP5CS和MvNHX l基因提髙棉花抗旱性的研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学硕士学位论文，2012.

[6]蔡永智.转CBF1和KatG基因棉花抗旱性分析[D].石河子：石河子大学硕士学位论文，2013.

[7]谢道听，范云六.苏云金芽抱杆菌杀虫晶体蛋白导人棉花获得转基因植株[J].中国科学（B辑），1991，4：367-373.

[8]郭三堆，崔洪志，夏兰芹，等.双价抗虫转基因棉花研究[J].中国农业科学，1999，32（3）：17.

[9]陈志贤，李淑君.棉花基因工程进展及应用前景[J].棉花文摘，1992，7（6）：1-3.

[10]张宝红.棉花抗虫基因工程研究进展[J].安徽农业科学.1994，22（4）：289-294.

[11]郭金英.转Bt+Sck双价基因抗虫棉的培育及其遗传稳定性研究[D].南京：南京农业大学博士学位论文，2006.

[12]孙小芳，郑靑松，刘友良，等.盐胁迫下不同基闪型棉花萌发生长和离子吸收特性[J].棉花宁报，2000，22（6）：26-29.