口腔鳞状细胞癌组织中差异微小RNA/mRNA表达谱的对接研究

刘思玉 谢龙 祁兵 马长艳 桑磊 李宏卫

1.南京医科大学口腔医学研究所；2.南京医科大学附属口腔医院口腔颌面外科；3.病理科；4.南京医科大学细胞生物学与医学遗传学系，南京 210029

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinomas，OSCC）是头颈部恶性肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤，其易发生细胞侵袭和转移，患者预后较差，术后5年的存活率低于50%[1]。研究[2]发现：OSCC的发生和发展受基因水平的调控，基因表达受DNA水平、转录水平、转录后水平及蛋白水平等多层面调控，过程复杂。近年来，微小RNA（microRNAs，miRNA）在转录后水平对基因表达的精细调控备受关注。大量研究[3-4]表明miRNA既可作为原癌基因参与恶性肿瘤的发生和发展过程，又可作为抑癌基因参与抑制恶性肿瘤的形成，其在肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及机体发育、代谢等基本生命活动过程中发挥重要作用，并可以作为OSCC早期诊断和治疗的生物标志物[5]。

据估计，人类基因组中miRNA的种类约有1 000多种，其在基因转录后通过抑制靶mRNA的翻译或降解mRNA调控近30%的人类基因[6]。因此，了解OSCC发生和发展相关的遗传过程及参与的生物学通路，为疾病的分级、早期诊断及治疗提供重要的信息，对新药的开发也有很大帮助[7-8]。因此，OSCC中差异miRNA/mRNA表达谱的对接研究显得尤为重要。

1 材料和方法

1.1 组织样本

选取10对冻存OSCC组织和配对癌旁正常组织作为研究对象，样本来源于2011年11月—2012年2月期间在江苏省口腔医院颌面外科接受手术治疗的OSCC患者，术前已经专业病理人员确诊为OSCC，且所有患者并未接受过任何放化疗或其他抗癌治疗，并获得每位患者书面同意。癌旁正常组织定义为病灶周围病理检查未见OSCC细胞的组织。样本经手术切除后立即于-80 ℃冻存收集。

1.2 构建差异miRNA表达谱

从OSCC样本和配对癌旁的样本中分别提取总RNA，回收18～30 nt大小的片段，通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）构建两组样本的cDNA文库。运用Illumina HiSeq 2000第二代高通量测序技术对两组样本的miRNA进行测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。参照miRNA数据库，比对已知miRNA，构建OSCC组织和配对癌旁组织的miRNA表达谱。将两个样本的miRNA表达量归一化到同一个量级，然后使用标准化后的结果比较分析两组样本中显著差异表达的miRNA，显著差异表达的miRNA定义为Fold-change（log2鳞癌/癌旁）＞1或者Fold-change（log2鳞癌/癌旁） ＜-1，并且P＜0.01。

1.3 构建差异mRNA表达谱

OSCC组织和配对癌旁组织的mRNA表达谱的构建方法同miRNA表达谱。差异基因的检测方法参照文献[9]，显著差异表达基因定义为Fold-change（log2鳞癌/癌旁）≥1或Fold-change（log2鳞癌/癌旁）≤-1，且发现错误率（false discovery rate，FDR）≤0.001。

1.4 OSCC和癌旁组织中差异表达miRNA/mRNA对接

运用Gene Ontology功能富集分析，将1.2和1.3的结果进行对接分析，预测与OSCC细胞周期、凋亡、增殖及分化相关性较高的miRNA和mRNA。

2 结果

2.1 OSCC和癌旁组织中差异miRNA表达谱

2.1.1 已知miRNA的统计 与人类miRNA数据库中的miRNA前体进行比对发现，在OSCC组织中，共检测到1 554个已知miRNA，包括255个miRNA成熟体，304个miRNA-3p，283个miRNA-5p，712个miRNA前体；在癌旁组织中，共检测到1 496个已知miRNA，其中有247个miRNA成熟体，297个miRNA-3p，268个miRNA-5p和684个miRNA前体。

2.1.2 OSCC和癌旁组织中差异表达的miRNA 对照OSCC和癌旁组织中已知的miRNA，共有77个miRNA显著性差异表达，其中53个显著性上调，24个显著性下调。上调表达最显著的10个miRNA分别为hsamiR-448、hsa-miR-1269b、hsa-miR-184、hsa-miR-411-3p、hsa-miR-1269a、hsa-miR-542-5p、hsa-miR-10b-3p、hsa-miR-129-1-3p、hsa-miR-450b-5p、hsamiR-409-5p，Fold-change（log2鳞癌/癌旁）分别为10.746 02、8.070 44、7.807 41、6.707 91、4.891 40、3.980 21、3.680 66、3.439 63、2.838 23、2.565 21；下调表达最显著的10个miRNA分别为hsa-miR-135a-5p、hsa-miR-96-3p、hsa-miR-676-3p、hsa-miR-375、hsa-miR-99a-3p、hsa-miR-4776-5p、hsa-miR-202-5p、hsa-miR-1246、hsa-miR-211-5p、hsa-miR-1323，Foldchange（log2鳞癌/癌旁）分别为-8.007 87、-6.920 41、-6.727 78、-3.751 05、-2.967 36、-2.958 51、-2.720 37、-2.341 79、-2.064 27、-1.894 38。

2.2 OSCC和癌旁组织中差异mRNA表达谱

在OSCC组织和癌旁组织中共发现1 298个mRNA差异表达，根据筛选标准，发现1 120个mRNA显著性上调，178个mRNA显著性下调。上调表达最显著的10个mRNA分别为MAGE-A11、PHACTR3、COL10A1、PPAPDC1A、EMR1、FAM132A、CHRNA1、LRRC17、ODZ3、BAALC，Fold-change（log2鳞癌/癌旁）分别为10.252 66、9.930 73、9.837 62、9.738 09、9.686 50、9.686 50、9.686 50、9.631 17、9.455 32、9.324 18；下调表达最显著的10个mRNA分别为TCHH、SYTL4、EPHX3、KRT33B、CTTNBP2、ESYT3、NCRNA-00162、SYTL5、CACNB4、CRTAC1，Fold-change（log2鳞癌/癌旁）分别-10.759 88、-9.607 33、-9.377 21、-8.939 57、-8.851 74、-8.758 22、-8.758 22、-8.758 22、-8.758 22、-8.661 77。

2.3 OSCC组织中差异表达miRNA/mRNA的对接研究

除了上调表达中的miR-1537、miR-20a-5p和下调表达中的miR-23b-5p、hsa-miR-210未寻找到相应调控的靶mRNA外，其余73个miRNA都在OSCC细胞周期、增殖、分化及凋亡过程中相应地调控一个或多个靶mRNA。

3 讨论

高通量测序技术堪称测序技术发展历程的一个里程碑，该技术可以对数百万个遗传分子同时进行测序，这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。近年来，以Illumina公司的Solexa技术、ABI公司的SOLiD技术和Roche公司的454技术为代表的新一代高通量RNA测序（RNA Sequencing，RNA-seq）技术得到飞速发展[10-11]，与基因芯片技术相比，RNA-seq无需设计探针，能在全基因组范围内以单碱基分辨率检测和量化转录片段，并能应用于基因组图谱尚未完成的物种，具有信噪比高、分辨率高、应用范围广等优势[12]。此技术已在肝癌、膀胱癌等常见癌的表达谱构建方面得到广泛应用[13-14]，但在OSCC表达谱构建方面的报道鲜见。本研究首次构建了OSCC的差异miRNA和mRNA表达谱，在该领域内具有先进性。

肿瘤细胞的周期改变、增殖、分化以及凋亡与肿瘤的发生发展密切相关，受到基因水平的调控，OSCC也同样如此。如S100A14的过表达，中止了OSCC细胞在G1期的有丝分裂，从而抑制了肿瘤的生长[15]；PLAU的高表达与OSCC的细胞增殖相关，已成为OSCC预后诊断的指标[16]；与凋亡相关的基因BCL2L12，与鳞癌的发生和发展密切相关[17]。

从对接研究结果来看，在细胞周期、增殖、分化和凋亡4个阶段，一个miRNA可以调控多个mRNA，如上调表达的miR-377-3p、miR-450a-3p、miR-424-5p等和下调表达的miR-96-3p、let-7c、miR-548h-5p等。同样，也发现一个mRNA被多个miRNA调控，预测这些差异表达的miRNA在OSCC的发生和发展过程中可能发挥一定的作用。如miRNA-184在舌鳞癌患者中表达上调，手术切除后明显减少[18]；miRNA-10b在口腔癌中高表达，其可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[19]；miR-9在头颈部鳞癌中高表达，其通过抑制肿瘤细胞的增殖发挥抑癌作用[20]；在OSCC中下调表达的miRNA-99a同肿瘤的生长密切相关[21]；下调表达的miR-125b在OSCC的发生和发展过程中发挥着作用[22]；miR-375在头颈部鳞癌中低表达[23]。

miRNA-21、miRNA-31等一些已报道的口腔鳞癌相关miRNA[24-25]，在研究中虽然也表现出一定的差异性，但是并不是很显著。此现象出现可能因选取的检测方法较以往研究不同，本研究采用高通量测序技术，获得庞大而详实的OSCC差异miRNA表达谱，较前可能会存在一定差异；其次可能因本研究的样本量偏少，导致结果有一些细微偏差，但并不影响整体的实验结果，笔者会在后续的研究中继续增加样本数量。

通过对OSCC和癌旁组织中miRNA和mRNA的对接研究，对miRNA与mRNA在OSCC中的相关关系有了更加深入的认识：单个miRNA可调控多个mRNA，一个mRNA同时又可受到多个miRNA的调控，它们相互交织、相互合作，形成精密、复杂的网络参与转录后的基因表达调控，在OSCC的发生和发展过程中发挥着重要的作用。随着OSCC中特异性miRNA的不断发现，通过生物信息技术，预测与之对应的靶基因，并对参与OSCC信号转导通路中的靶基因进行验证，对OSCC早期诊断和治疗提出了一些新的思路和方法。

[1]Brocklehurst PR, Baker SR, Speight PM. Oral cancer screening: what have we learnt and what is there still to achieve[J].Future Oncol, 2010, 6(2):299-304.

[2]Williams HK. Molecular pathogenesis of oral squamous carcinoma[J]. Mol Pathol, 2000, 53(4):165-172.

[3]Kong YW, Ferland-McCollough D, Jackson TJ, et al. micro-RNAs in cancer management[J]. Lancet Oncol, 2012, 13(6):e249-e258.

[4]Lopez-Camarillo C, Marchat LA, Arechaga-Ocampo E, et al. MetastamiRs: non-coding microRNAs driving cancer invasion and metastasis[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13(2):1347-1379.

[5]Heneghan HM, Miller N, Kerin MJ. MiRNAs as biomarkers and therapeutic targets in cancer[J]. Curr Opin Pharmacol,2010, 10(5):543-550.

[6]Visone R, Croce CM. MiRNAs and cancer[J]. Am J Pathol,2009, 174(4):1131-1138.

[7]Nagpal JK, Das BR. Oral cancer: reviewing the present understanding of its molecular mechanism and exploring the future directions for its effective management[J]. Oral Oncol, 2003, 39(3):213-221.

[8]Reibel J. Prognosis of oral pre-malignant lesions: signi fi -cance of clinical, histopathological, and molecular biological characteristics[J]. Crit Rev Oral Biol Med, 2003, 14(1):47-62.

[9]Bos CL, van Baarsen LG, Timmer TC, et al. Molecular subtypes of systemic sclerosis in association with anti-centromere antibodies and digital ulcers[J]. Genes Immun, 2009, 10(3):210-218.

[10]Metzker ML. Sequencing technologies-the next generation[J]. Nat Rev Genet, 2010, 11(1):31-46.

[11]Marioni JC, Mason CE, Mane SM, et al. RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays[J]. Genome Res, 2008, 18(9):1509-1517.

[12]Birzele F, Schaub J, Rust W, et al. Into the unknown: expression profiling without genome sequence information in CHO by next generation sequencing[J]. Nucleic Acids Res, 2010, 38(12):3999-4010.

[13]Zhu J, Jiang Z, Gao F, et al. A systematic analysis on DNA methylation and the expression of both mRNA and micro-RNA in bladder cancer[J]. PLoS ONE, 2011, 6(11):e28223.

[14]Li X, Chen J, Hu X, et al. Comparative mRNA and micro-RNA expression profiling of three genitourinary cancers reveals common hallmarks and cancer-speci fi c molecular events[J]. PLoS ONE, 2011, 6(7):e22570.

[15]Sapkota D, Costea DE, Blø M, et al. S100A14 inhibits proliferation of oral carcinoma derived cells through G1-arrest[J]. Oral Oncol, 2012, 48(3):219-225.

[16]Hundsdorfer B, Zeilhofer HF, Bock KP, et al. Tumour-associated urokinase-type plasminogen activator (uPA)and its inhibitor PAI-1 in normal and neoplastic tissues of patients with squamous cell cancer of the oral cavity-clinical relevance and prognostic value[J]. J Craniomaxillofac Surg,2005, 33(3):191-196.

[17]Geomela PA, Kontos CK, Yiotakis I, et al. Quantitative expression analysis of the apoptosis-related gene, BCL2L12,in head and neck squamous cell carcinoma[J]. J Oral Pathol Med, 2013, 42(2):154-161.

[18]Wong TS, Liu XB, Wong BY, et al. Mature miR-184 as potential oncogenic microRNA of squamous cell carcinoma of tongue[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(9):2588-2592.

[19]Lu YC, Chen YJ, Wang HM, et al. Oncogenic function and early detection potential of miRNA-10b in oral cancer as identi fi ed by microRNA pro fi ling[J]. Cancer Prev Res: Phila,2012, 5(4):665-674.

[20]Minor J, Wang X, Zhang F, et al. Methylation of micro-RNA-9 is a speci fi c and sensitive biomarker for oral and oropharyngeal squamous cell carcinomas[J]. Oral Oncol,2012, 48(1):73-78.

[21]Yan B, Fu Q, Lai L, et al. Downregulation of microRNA 99a in oral squamous cell carcinomas contributes to the growth and survival of oral cancer cells[J]. Mol Med Rep, 2012, 6(3):675-681.

[22]Henson BJ, Bhattacharjee S, O’Dee DM, et al. Decreased expression of miR-125b and miR-100 in oral cancer cells contributes to malignancy[J]. Genes Chromosomes Cancer,2009, 48(7):569-582.

[23]Harris T, Jimenez L, Kawachi N, et al. Low-level expression of miR-375 correlates with poor outcome and metastasis while altering the invasive properties of head and neck squamous cell carcinomas[J]. Am J Pathol, 2012, 180(3):917-928.

[24]Wang W, Songlin P, Sun Y, et al. miR-21 inhibitor sensitizes human OSCC cells to cisplatin[J]. Mol Biol Rep, 2012, 39(5):5481-5485.

[25]Liu CJ, Lin SC, Yang CC, et al. Exploiting salivary miR-31 as a clinical biomarker of oral squamous cell carcinoma[J].Head Neck, 2012, 34(2):219-224.