生长分化因子9在卵泡生长发育中的调控

曹明雅（综述），赵志明（审校）

（河北医科大学第二医院生殖医学科，河北 石家庄 050000）

生长分化因子9在卵泡生长发育中的调控

曹明雅（综述），赵志明*（审校）

（河北医科大学第二医院生殖医学科，河北 石家庄 050000）

生长分化因子9；卵泡；卵母细胞；综述文献

生长分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF-9）是卵源性的生长因子，亦是由卵母细胞通过旁分泌方式产生，在卵泡生长和发育的调节中具有重要作用，属于转化生长因子β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）超家族。现对GDF-9在卵泡生长发育中的调控作用、甾体激素的合成及其在不孕治疗过程中对卵母细胞质量的影响等进行综述。

1 GDF-9的结构与表达部位

GDF-9是TGF-β超家族的成员之一。人类GDF-9基因定位于5q31.3上，含有1.6kb的内含子及2个外显子，与已知的该家族其他成员相比，具有高度同源性的GDF-9多肽序列由包括1～27个氨基酸编码的信号肽序列、318个氨基酸残基的前结构域和含有135个残基的成熟结构域共454个氨基酸组成。但GDF-9的成熟结构域仅有6个保守的半胱氨酸残基，而TGF-β家族中有7个保守的半胱氨酸残基，因此GDF-9是以异源二聚体形式存在还是共价结合的同源二聚体形式存在仍存在争议，有待进一步研究。

GDF-9主要由卵巢产生并表达于特定细胞而发挥作用。但在人类及不同物种之间其表达的时间和定位不同。人类的性腺组织及非性腺组织中均可表达GDF-9mRNA［1］。在灵长类动物的卵巢中，卵母细胞、丘颗粒细胞以及壁层颗粒细胞中均有GDF-9表达。一篇以成年雌性恒河猴为研究对象的文献也报道［2］，在促性腺激素高峰至排卵期间，GDF-9表达于所有的卵母细胞、丘颗粒细胞及其腔壁颗粒细胞，并且还检测到了GDF-9蛋白在卵泡液中也有表达。与之相反，在啮齿类动物中则颗粒细胞上未检测到GDF-9的表达而仅于卵母细胞上检测到。对体外培养的人类颗粒细胞采用定量逆转录－聚合酶链反应与免疫印迹法（Western Blot）检测发现其也可表达GDF-9。

2 GDF-9与卵泡的发育

卵泡的发育主要由2个阶段构成，即不依赖促性腺激素阶段（主要是指原始卵泡和初级卵泡阶段）和依赖促性腺激素阶段（主要是指窦卵泡阶段）。对正常的卵泡发育来说，GDF-9是必需的，并且通过特异性表达于人类及大多数哺乳动物的卵巢组织而与其一同维持卵巢功能并发挥作用。

2.1 GDF-9对原始卵泡及窦前卵泡的调控：卵泡发育由原始卵泡的卵母细胞产生GDF-9开始。对于早期卵泡发育GDF-9是必需的，缺失GDF-9的雌性小鼠其卵泡发育大多停滞在初级卵泡（单层颗粒细胞）阶段［3］。在人类的卵巢组织中加入重组GDF-9进行体外培养后，大量的始基卵泡启动生长，卵泡闭锁减少，卵泡更多的存活、生长并发育至次级卵泡阶段［4］。这说明GDF-9不仅能够对原始卵泡的募集进行诱导，还能够促进初级卵泡过渡到小窦前卵泡期。对未发育成熟的大鼠给予重组GDF-9后，大鼠的卵巢质量增加，初级卵泡数及小窦前卵泡数也增加，分别为30%和60%，而原始卵泡的数量减少了29%［5］。此外，GDF-9还对早期卵泡的进一步生长与分化起着重要作用，卵母细胞分泌的内源性GDF-9是一种重要的有丝分裂原。

应用RNA干扰技术体外阻断GDF-9由窦前卵泡过渡到窦卵泡期的表达，无论是窦前卵泡的基础发育还是卵泡刺激素诱导下的发育均受阻；可能原因是 GDF-9被阻断后，细胞凋亡蛋白酶 3（Caspase-3）被激活，而激活Caspase-3促使窦前卵泡发生凋亡。相反，增加外源性GDF-9则可以对窦前卵泡发育起促进作用而对抗Caspase-3对其促凋亡的作用。因此，GDF-9可能通过这种对窦前卵泡抗凋亡的调控，在其向早期窦卵泡的生长发育过程中起到促进作用［6］。

2.2 GDF-9对促性腺激素依赖阶段卵泡的调控：在该阶段，影响卵泡发育的主要因素有卵泡膜细胞、颗粒细胞、卵丘及卵母细胞，GDF-9正是通过对这些细胞发挥作用而影响卵泡发育的。GDF-9对颗粒细胞的增殖有明显促进作用［7－8］。同时，GDF-9亦能够给予卵母细胞最适宜生长的内环境，这是通过调节卵丘扩展中起关键作用的酶的活性，有利于形成含丰富透明质酸的细胞外基质实现的。另外，重组GDF-9直接上调和卵丘膨胀相关的透明质酸酶2及前列腺素内过氧化物酶2、肿瘤坏死因子诱导蛋白6及正五聚蛋白 3的合成，而使尿激酶纤溶酶原激活物mRNA合成被抑制，GDF-9对这些基因表达的调控，最终影响了卵丘的扩张及晚期卵泡的发育［］。

3 GDF-9对颗粒细胞影响

卵源性GDF-9能够刺激小窦卵泡至排卵前卵泡的颗粒细胞增生［10］，因此，颗粒细胞是其重要的靶细胞。对大鼠进行体外研究，发现GDF-9反义核苷酸可以下调颗粒细胞上促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，FSH）受体mRNA的表达，使基础状态以及促卵泡生成素刺激下的窦前卵泡的生长被抑制，同时还可以激活细胞蛋白凋亡酶增加窦前卵泡的凋亡，但外源性GDF-9的加入可以对抗该作用。加入GDF-9后卵泡的发育数增加，GDF-9通过激活GDF-9磷脂酸激酶3通路，抑制颗粒细胞的凋亡和闭锁，从而保护颗粒细胞免受凋亡，促进窦前到窦卵泡的生长。这一结果提示颗粒细胞上FSH受体发生异常，使其对FSH受体的反应性下降，从而影响窦前期和早窦状卵泡的生长，是由于GDF-9缺陷造成，因此FSH受体要正常发挥作用足量的GDF-9是必需的［11］。反之，FSH也能调节GDF-9受体的表达，还能调节环氧合酶 2（环氧合酶（cyclooxygenase，COX-2）表 达，并 且 雌 二 醇（estradiol，E2）和FSH协同增强 GDF-9受体在培养的颗粒细胞中的表达［12－13］，从而影响颗粒细胞的增殖、分化，卵丘的扩散，类固醇激素的合成以及卵母细胞的成熟排卵和黄体化。

将卵丘颗粒细胞包裹的卵母细胞去除明显增加了丘颗粒细胞凋亡率，而加入裸卵则显著降低其凋亡率，并且发现丘颗粒胞的凋亡率与其跟卵母细胞之间的距离呈梯度增加的关系，这说明卵丘颗粒细胞的凋亡与卵母细胞分泌的某些细胞因子有关，GDF-9可能通过促进颗粒细胞中蛋白激酶B磷酸化抑制颗粒细胞凋亡［14］。

4 GDF-9对卵母细胞的影响

GDF-9缺乏的卵母细胞不能进行减数分裂［15］。对GDF-9缺失的小鼠进行研究发现，其卵泡大多于初级阶段停止发育，观察超微结构显示卵母细胞的高尔基体发生异常，核周细胞器呈退化表现，皮质激素无法正常合成，与周围细胞之间异常的缝隙连接，穿越透明带时减少的微管，最终导致卵周隙损害，使卵母细胞死亡。同时，GDF-9的缺失还可以间接影响卵母细胞从生长、发育至成熟的过程，主要是通过上调抑制素α（存在于卵泡颗粒细胞上）及kit配体的表达而实现［16］。由于卵母细胞与颗粒细胞之间存在双向联系，所以卵母细胞可以通过调节颗粒细胞的功能来调控卵泡内的微环境，从而满足其自身生长的需要。促性腺激素可以促进正常卵母细胞中GDF-9的产生。由于这种卵源性因子的参与，卵母细胞和卵丘细胞之间形成了双向的调节，推测其表达水平异常可能影响卵母细胞－卵丘复合体的结构和功能，从而导致卵母细胞质量和发育潜能受损［3］。

5 GDF-9激素合成

GDF-9可以影响卵巢内的卵泡膜细胞上类固醇激素合成。将小鼠的GDF-9基因敲除，则其卵泡膜细胞分化缺陷，存在于卵泡膜上的促黄体生成素（luteotropic，LH）受体、ckit受体（Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受体超家族成员）和17α-羧化酶等分化标志物缺乏，从而阻碍卵泡膜细胞的分化，但在给予外源性GDF-9后，用 Western Blot法测定卵巢匀浆中的17α-羧化酶量，发现显著增加。表明GDF-9还能够通过影响卵巢卵泡膜细胞类固醇激素和相关因子的产生，影响卵泡的发育和分化。GDF-9影响卵泡类固醇激素的生成，尤其对卵泡膜细胞功能的调节具有重要作用［2］。

GDF-9可通过调节FSH的活性而影响FSH对颗粒细胞的作用［17］。在颗粒细胞未分化前，GDF-9调节颗粒细胞的生长，主要是通过降低FSH的生物学效应，避免颗粒细胞提前黄素化实现。在小窦卵泡发育至排卵前卵泡阶段，GDF-9对雌孕激素的生成及FSH刺激下的颗粒细胞生长起促进增强的作用，同时又抑制颗粒细胞的分化，并降低FSH、胰岛素生长因子Ⅰ、8.Br.环磷酸腺苷和FSH共同刺激下的包括E2、孕酮（progesterone，P）、细胞色素p450胆固醇侧链裂解酶和细胞色素芳香化酶p450、类固醇生成急性调节蛋白以及淋巴细胞归巢受体等甾体激素的生成［2］，这提示GDF-9可能是一种来源于卵巢，对避免生长卵泡中的颗粒细胞过早分化起抑制作用的黄素化抑制因子。相反，当颗粒细胞已被FSH／LH激活至排卵前，GDF-9则可以使其分化状态发生改变，上调其下游靶基因COX-2基因及前列腺素受体mRNA的表达水平，促进卵丘细胞上孕激素的合成［18］。

6 GDF-9与辅助生殖

目前，促排卵治疗在不孕症中的应用主要是通过对促卵泡生成素敏感的窦前卵泡以及窦卵泡应用促性腺激素，从而使其募集到更多进入发育池，但对于促卵泡生成素不敏感的窦前及窦卵泡则没有有效方法。近年来，随着对GDF-9在卵泡生长、发育和成熟过程中的作用以及其表达调控机制的研究日益深入，是否可以考虑对促性腺激素反应不敏感的患者，通过外源性给予GDF-9以促进卵泡的发育，而促使体内对促性腺激素发生反应的卵泡数量增加来解决上述问题。另外，未成熟卵的体外培养在技术上还存在诸多问题，如卵母细胞成熟度不高、受精率低、胚胎发育潜能欠佳、与正常胚胎比细胞卵裂时更易发生阻滞和延迟等。在动物卵母细胞体外培养体系中进一步发现，外源性加入卵源性因子可以提高囊胚形成率和胎儿存活率［6］。此外，有些研究已经尝试在人类或哺乳动物某一阶段卵泡的体外培养中加入重组的具有生物活性的GDF-9，结果发现其对早期卵泡的生长有促进作用［19］。GDF9表达水平变化有望成为卵母细胞胞质成熟和细胞质量的评价指标。

综上所述，GDF-9是由卵母细胞分泌，并通过自分泌、旁分泌的方式作用于卵巢，协同维持卵巢的生殖和内分泌功能，通过影响颗粒细胞增殖、卵丘扩展、激素合成、降低颗粒细胞凋亡率等影响卵母细胞的质量，从而影响体外受精－胚胎移植妊娠率。

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（本文编辑：许卓文）

R711.75

A

1007-3205（2014）10-1231-04

2014－01－20；

2014－02－24

曹明雅（1986－），女，河北石家庄人，河北医科大学第二医院医学硕士研究生，从事生殖医学研究。

*通讯作者。E-mail：zhaozhiming73＠163.com

10.3969／j.issn.1007-3205.2014.10.045