蚕丝蛋白生物高分子材料的应用研究新进展

邓连霞，张海萍，杨明英，朱良均

（浙江大学应用生物资源研究所，浙江杭州 310058）

蚕丝蛋白生物高分子材料的应用研究新进展

邓连霞，张海萍，杨明英，朱良均

（浙江大学应用生物资源研究所，浙江杭州 310058）

本文综述了浙江大学应用生物资源研究所生物资源高分子材料实验室近5年来在蚕丝蛋白（丝素和丝胶）高分子材料在高吸水材料、支架材料、医用生物材料等领域的应用研究成果。

蚕丝蛋白；丝素；丝胶；高分子材料

蚕丝蛋白是一种性能优良的天然蛋白，传统上应用于丝绸面料、纤维服饰等领域。随着科技的进步，蚕丝蛋白越来越多地被应用于生物高分子材料领域，这对拓展蚕丝蛋白新用途、提高蚕丝行业整体经济效益等方面具有重要意义。

浙江大学生物资源与生物高分子材料实验室，多年来致力于蚕丝蛋白的基础研究［1～2］和蚕丝蛋白高分子材料的应用研究，取得了一些阶段性成果。现把近5年来本实验室在蚕丝蛋白高分子材料应用研究取得的一些进展概述如下。

1 丝素方面

1.1 丝素基高吸水材料

高吸水材料是一种具有较高吸水性能和保水性能的新型高分子材料［3］。高吸水材料经适度交联形成一定的三维网络结构，含有强亲水基团，可通过水合作用迅速地吸收自重几百倍乃至上千倍的水而成凝胶状聚合物［4］。与传统的吸水材料不同，高吸水材料具有吸水倍率大，吸水速率快，保水能力强，有效持续性强且无毒无味等优点［5］。

汪琦翀等［6-7］以具有良好生物分解性能的丝素蛋白（SF）为原料，将其与丙烯酸（AA）和丙烯酰胺（AM）共聚合成一种新型的丝素蛋白/丙烯酸/丙烯酰胺吸水材料（SF/AA/AM），用红外吸收光谱（FTIR）、扫描电镜（SEM）、差示扫描量热仪（DSC）对其结构与性能进行了分析，并对材料的吸水和保水性能进行了测定。结果表明：SF/AA/AM吸水材料在去离子水、自来水和0.9%NaCl溶液中的吸水倍率分别为220～308 g/g，135～210 g/g，24.3～34.8 g/g。丝素蛋白与丙烯酸和丙烯酰胺聚合良好，丝素蛋白引入后，使材料的热分解温度升高，材料具有较高的熔融温度，吸水比表面增加。本研究为进一步研发具有生物分解性的新型高吸水材料提供参考。

1.2 新型丝素支架材料的体内降解［8］

丝素材料因其良好的生物相容性、可降解吸收性和能制备成多种形态的材料等性能，在组织工程支架材料方面的应用被人们广泛关注。目前在支架材料制备及材料与各种哺乳动物细胞的相容性研究等方面已经取得诸多成果。随着对丝素支架材料研究向组织构建和修复应用方面的深入，调控丝素支架材料在体内的降解吸收过程显得十分重要。

将冷冻干燥法制备的新型丝素支架材料植入兔耳皮下进行体内降解试验。肉眼外观观察发现植入丝素支架材料部位的皮肤无明显红肿，经过28周左右皮下材料植入部位的突起逐渐消失；组织切片观察发现丝素支架材料引起的组织反应较弱；扫描电镜在28周时只观察到将近消失的丝素支架材料种植腔，表明材料已基本降解。相比之下28周时丝素膜仍完好，无明显降解。研究结果表明，冷冻致孔新型丝素支架材料有望开发成为一种生物相容性优良的可降解吸收性组织工程支架材料。

1.3 羟基磷灰石/丝素复合支架［9，10］

骨形态发生蛋白2（BMP-2）是转录生长因子β（TGF-β）家族成员之一，具有促进成骨细胞分化、诱导骨组织再生的能力，目前已广泛应用于骨组织工程研究之中。羟基磷灰石（HA）是天然骨组织的主要无机成分，具有骨诱导性，能够诱导新生骨的血管化，促进新骨的形成，且植入体内后不会引起炎症反应，常用作骨修复材料。丝素蛋白（SF）因其良好的生物相容性、降解性及独特的力学性能等，广泛用于生物医学领域。张艳红等在大肠杆菌原核表达系统进行重组人的骨形态发生蛋白2（rhBMP-2）的表达，并通过体外复性获得了rhBMP-2重组蛋白。利用该重组蛋白与HA/SF支架复合，制备了新型复合支架材料。通过体内外实验表明，该材料的生物相容性良好，是一种潜在的骨修复材料。

1.4 丝腺丝素支架材料

相比于从茧壳里采取一些化学试剂溶解的方法提取丝素，直接从丝腺里提取丝素更加环保。杨明英等［11］采用直接从丝腺里提取的丝素制备了支架材料。丝素取自五龄第7 d的家蚕的中部丝腺。用冷冻干燥的方法制备了多孔支架。SDS-PAGE分析表明丝素分子量多在200 kDa以上。SEM（扫描电镜）分析显示支架孔径均一且孔径大小随着丝素溶液浓度的增大而减小。通过力学万能测试机测试，支架的压缩模量达6.9±0.4 MPa。另外通过细胞增殖实验表明，丝素支架具有较高的细胞粘附能力和增殖能力，同时也显示出较高的碱性磷酸酶活性。丝腺丝素支架良好的抗压能力和生物相容性使其有望应用于骨组织工程。

1.5 丝素/壳聚糖复合支架

施李杨等［12］以丝素和壳聚糖为原料，采用冷冻干燥法制备丝素/壳聚糖支架，通过预矿化使羟基磷灰石（HA）沉积，形成多孔羟基磷灰石-丝素蛋白/壳聚糖复合支架。对复合支架进行红外吸收光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）、热重分析（TGA）、力学性能和空隙率表征；采用WST-1方法检测MG-63骨肉瘤细胞在复合支架上的增殖情况，评价其细胞相容性。结果显示，沉积的HA结构属于弱结晶态范畴，主要位于孔壁上，且随着预矿化循环次数的增加沉积量增多，使预矿化复合支架的弹性模量得到极显著地提高，其孔隙率保持在90%左右的较高水平；WST-1检测表明，含有HA的预矿化复合支架对细胞增殖有明显的促进作用，具有良好的细胞相容性。

1.6 海绵状丝素敷料

因丝素蛋白良好的生物相容性，早在2500年前，丝素就被作为手术缝合线应用于生物医用材料方面。闵思佳等［13］采用纳米银颗粒和1.25～5.0%（v/v）缩水甘油醚混合，再与丝素溶液共混冷冻干燥后得到海绵状的丝素敷料。对敷料的力学性能，透气性和吸湿性能进行表征，发现材料具有良好的拉伸强度和弹性，敷于伤口上发现材料透气性和吸湿性能均不错。吸湿率能每小时达到101 g/m2，在干态和湿态下的吸湿倍率分别达到595.2%和251.9%。敷料中的纳米银在PBS缓冲液中处于相对稳定状态，抗菌性能良好。用新西兰兔做实验，将敷料敷于其背部创伤皮肤，发现17.7±2.4 d后创伤完全愈合，明显快于作对照的猪皮敷料。以上实验结果表明，海绵状丝素敷料有巨大潜力应用于人体皮肤创伤方面。目前这一研究已进入临床试验阶段。

2 丝胶方面

2.1 海绵状纯丝胶凝胶支架

丝胶在自然状态下能够形成凝胶，但机械性能较差，不能满足生物材料的要求。通过与其他生物高分子（如聚乙烯醇等）复合或用交联剂进行化学修饰，可以明显地提高丝胶凝胶的机械性能。而化学试剂的添加容易降低材料的生物相容性，因此若能少用或不用化学试剂来研制丝胶凝胶材料将是一个重要突破。张海萍等［14］以沸水法提取的普通茧层丝胶为原料，在不添加化学交联剂的条件下，采用冷冻解冻的方法制备出一种新型的海绵状丝胶凝胶支架材料。通过对不同制备条件（如丝胶浓度、冷冻时间、冷冻温度和冷冻解冻次数等）下丝胶凝胶生成率的比较分析，确定了效率最高的丝胶凝胶制备工艺条件。并对不同条件下制备丝胶凝胶的多孔结构、孔径大小和形态结构等进行了研究，为开发实用性凝胶支架材料建立了基础。

2.2 丝胶/甘油混合膜［15］

一直以来，由于丝胶的力学性能欠佳，限制了其在组织工程等方面的应用。为改善丝胶膜的力学特性，在丝胶溶液中添加适量甘油以期能改变其性能。结果表明，不论在干态还是湿态下，均可以通过调节甘油的量来调节丝胶膜的拉伸性能。ATR-FT⁃IR（傅里叶红外光谱全反射）和热分析（TGA和DSC）均表明甘油的加入促进了膜的无定形结构的形成。SEM（扫描电镜）结果表明甘油的量在10 wt%时，丝胶和甘油混合得比较均一。丝胶膜拉伸性能的改善对其力学性能是一个优化，增加了丝胶基高分子材料在组织工程应用的可能性。

2.3 丝胶蛋白/羟基磷灰石复合支架材料［16］

复合骨支架是重要的骨组织修复材料。用氢氧化钙和磷酸湿法合成羟基磷灰石，按一定的比例加入到浓缩后的丝胶溶液中，经冷冻干燥制备丝胶蛋白/羟基磷灰石复合骨支架材料。通过SEM、XRD、FTIR、DSC及力学性能等检测方法，探讨了制备工艺条件对丝胶/羟基磷灰石复合支架材料的影响及结构性能。结果表明，丝胶/羟基磷灰石复合支架材料的孔隙分散均匀且孔与孔之间相互贯通，孔隙率为33.0%～62.5%；为弱结晶，与人体骨中晶体态相似；分子呈β结构，热分解温度提高，热学性能发生变化；弹性模量最大为15.64 MPa。具有较好的力学性能。

2.4 丝胶蛋白基复合吸水材料

目前广泛使用的聚丙烯酸类高吸水材料生物降解性能差，对生态环境造成危害，同时其原料来源于日益枯竭的石油资源。因此，研究可生物降解吸水材料，对于减少环境污染等具有重要意义。丝胶蛋白是一种天然高分子，一般作为制丝生产的废弃物。丝胶蛋白的氨基酸中含有大量极性基团（如-OH、-COOH、-NH2等），具有较好的亲水性、反应活性和生物降解性。如能将丝胶蛋白变废为宝作为生物资源加以利用，研制丝胶蛋白基可生物降解吸水材料，不仅丰富了吸水材料类型，也为丝胶蛋白资源利用提供了一条新途径［17］。

本实验室在丝素蛋白基吸水材料的基础上，以丝胶（Sericin）为原料，丙烯酸（AA）和丙烯酰胺（AM）为单体，合成了具有生物降解性能的Sericin/PAAAM复合吸水材料。研究了Sericin/PAA-AM复合吸水材料的合成条件如丝胶蛋白用量、单体配比、交联剂用量、引发剂用量、中和度、反应温度、溶液pH等对复合吸水材料吸水性能的影响，在单因素试验的基础上，设计五因素四水平正交试验获得了最适宜的制备条件：反应温度60°C，反应时间2 h，丝胶与单体的配比为1∶2，AA和AM的配比为2，引发剂用量为单体用量的2%，交联剂用量为单体用量的0.3%，中和度为70%，pH为7。复合吸水材料的吸收去离子水倍率为483 g/g，吸收自来水倍率为296 g/g，吸收0.9%NaCl溶液倍率为52 g/g［18］。

考虑到Sericin/PAA-AM复合吸水材料吸水量的不足，尝试把热水沸煮提取的丝胶蛋白再用碱性蛋白酶进一步水解得到不同分子量分布的丝胶溶液，并研究酶解改性处理条件对丝胶蛋白分子量分布的影响。研究表明，酶解浓度越高，丝胶蛋白分子量越小。在此基础上，选择合适的酶解改性丝胶蛋白，进一步与丙烯酸/丙烯酰胺复合单体进行接枝共聚，研制具有生物降解性的酶解丝胶/丙烯酸/丙烯酰胺复合吸水材料，研究不同酶解改性丝胶蛋白复合吸水材料的结构与性能差异，阐明丝胶蛋白结构差异对复合吸水材料的接枝率、吸水性、保水性、生物降解性等的影响机制。研究表明，当碱性蛋白酶和丝胶的质量比为5 mg/g时，酶解丝胶/丙烯酸/丙烯酰胺复合吸水材料的接枝率、吸水率、保水率、生物降解均达到最大。在此条件下，经冷冻干燥的酶解丝胶/丙烯酸/丙烯酰胺复合吸水材料吸收去离子水倍率达到896 g/g，吸收自来水倍率为424 g/g，吸收0.9%NaCl溶液倍率为83 g/g。

本研究对于丝胶蛋白基生态功能材料研发具有参考意义。

2.5 丝胶蛋白/羟基磷灰石复合膜

王雪云等［19］以乙醇处理的家蚕丝胶膜为模板，采用氯化钙和磷酸氢二钠溶液交替浸渍的方法，研究经不同矿化周期处理丝胶膜上的矿化物沉积及对丝胶膜结构的改变情况。通过红外吸收光谱（FT⁃IR）、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）和X射线能谱（EDX）对表面沉积矿化物的丝胶膜进行微观形貌与结构表征，发现矿化物能快速有效地在丝胶膜表面沉积和生长，随着矿化周期的增加，矿化物的沉积量不断增加，丝胶膜表面的结晶度略有提高，沉积的矿化物呈龟裂、薄板状，主要成分为无定形磷酸钙盐。

将矿化第7 d的复合膜材料和乙醇预处理丝胶膜与MG-63人成骨瘤细胞进行体外培养，通过细胞形态学观察和XTT比色法检测研究复合材料的生物相容性。结果表明，复合膜材料更能促进MG-63细胞的增殖和生长。

3 展望

随着生物技术的日新月异，研究手段的不断进步，目前国内外对蚕丝蛋白的基础研究和蚕丝蛋白高分子材料的应用研究都越来越深入，并已取得了一些有价值的成果。蚕丝蛋白的诸多优良性能使得蚕丝蛋白高分子材料应用前景广泛，这对拓展蚕丝资源利用新途径，促进蚕丝业循环经济建设发展等方面意义重大。不过由于技术条件等的限制，目前蚕丝蛋白高分子材料的很多应用研究还处在实验室阶段。要让其真正走向市场，还需要突破一些技术限制，任重而道远。

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New Progress in Applied Research of Silk protein biopolymer materials

DENG Lian-xia,ZHANG Hai-ping,YANG Ming-ying,ZHU Liang-jun
（Institute of Applied Bioresources,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China）

This paper summarized the application research achivement of silk protein biopolymer materials in superabsor⁃bent polymer,scaffold,biomaterials and other fields of the laboratory of Bio-resources and Macromolecuar Material Insti⁃tute of Applied Bioresources,Zhejiang University in recent 5 years.

silk protein;fibroin;sericin;biopolymer materials

S886.9

A

0258-4069［2014］03-005-04

现代农业产业技术体系专项（CARS-22）

邓连霞（1986-），女，湖北荆州人，博士后，从事蚕丝蛋白生物资源高分子材料研究。E-mail：denglianxia2008@163.com

朱良均，教授，博士生导师。E-mail：ljzhu@zju.edu.cn