RNA干扰抑制Galectin-3表达对肿瘤细胞生物学性状影响研究进展

吴雪艳，江小华

(1.河北联合大学基础医学院，河北唐山 063009;2.承德医学院)

肿瘤是全球疾病致死的重要元凶之一。据统计，全球新肿瘤患者每10万人中就有173人，在中国每10万人中有110人。抑制癌的增殖，促进其凋亡，可达到降低死亡率的目的,有效敲除与癌有关的基因的表达可望降低肿瘤的发生率。干扰技术作为一种从反向研究基因，特别是癌基因的生物学作用, 已经被用到基因的信号转导方面。Galectin-3是目前认为与肿瘤发展关系密切的基因，近年来，随着RNA干扰技术的应用，人们对抑制Galectin-3表达后肿瘤细胞生物学性状的改变研究越来越多，本文对此做一综述。

1 Galectin-3的结构与功能

β-半乳糖苷结合蛋白-3(Galectin-3)属于动物凝集素，是β半乳糖凝集素的成员之一，它包括三个结合域:NH2末端结合域、一个糖结构识别域(carbohydrate recognition domain，CRD)和一个特有的富含甘氨酸、脯氨酸和酪氨酸重复序列的结构域[1]，具有调节细胞生长和抑制细胞凋亡[2,3]、介导细胞黏附[4]、参与新生血管形成[5]、调控细胞转录等作用，在正常细胞及肿瘤细胞中广泛表达，与细胞内糖蛋白、细胞表面分子及细胞外基质蛋白相互作用，参与许多生理和病理过程，包括细胞生长、细胞黏附、细胞凋亡、肿瘤血管生成，以及肿瘤的侵袭转移。

2 Galectin-3与肿瘤

肿瘤的发生和发展是正常细胞在生长调节机制紊乱下产生的恶性转化和异型增生。Yoshii等[6]和Takenaka等[7]研究发现，正常甲状腺滤泡细胞转染Galectin-3 cDNA后，Galectin-3表达增加，导致细胞获得恶性表型，提示Galectin-3可能在维持甲状腺癌细胞的恶性表型中发挥作用。很多研究表明，Galectin-3的表达水平与肿瘤的恶性程度有密切关系。Camby等[8]研究发现，Galectin-3的表达水平随着星形细胞胶质瘤分级增高而上升，Galectin-3在体外明显刺激胶质母细胞瘤的移动。Yang等[9]通过实时荧光定量RT-PCR检测研究发现，Galectin-3在正常胃黏膜为弱表达，表达水平很低，而胃癌原发灶、胃癌淋巴结转移灶及胃癌腹膜转移灶中Galectin-3 mRNA表达增高。这提示Galectin-3与肿瘤的侵袭和转移等恶性特征密切相关。

3 RNA干扰技术

RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的特异同源靶基因转录后沉默的过程[10]。RNAi可以通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA，诱导内源靶基因mRNA降解，从而实现阻止基因表达。故RNAi可以作为一种简单、有效的可代替基因敲除技术来抑制特定基因表达。

RNAi引发基因沉默大致分为三个阶段:起始阶段、效用阶段、扩增阶段。(1)起始阶段:dsRNA在细胞内被一双链RNA酶III型内切酶(如Dicer酶)切割产生siRNA片断;(2)效应阶段:siRNA与RNAi特异性的核酸内、外切酶及其它一些蛋白等一起形成核糖核苷酸蛋白复合物(RNA inducing silencing complex,RISC)，RISC 的核酸部分起到靶向性的作用，蛋白部分则起到降解mRNA的作用;(3)扩增阶段:siRNA与mRNA靶向性结合，并作为引物，在RNA聚合酶的作用下再次形成dsRNA，新形成的dsRNA又被Dicer切割成siRNA，新形成的siRNA又可以进入下一轮循环而达到扩增效应的目的，一个完整的mRNA被降解成多个21-23nt的小片段，从而导致相应的基因表达沉默。

RNAi具有高效性、高特异性、遗传性、可传播性、靶基因位点的高选择性与浓度、时间及ATP依赖性等几个特点。

4 RNA干扰抑制Galectin-3表达对肿瘤细胞生物学性状的影响

4.1 恶性胶质瘤 脑胶质瘤是发生于神经外胚层的恶性肿瘤，约占脑肿瘤的45%左右，呈浸润性生长，显微手术难以达到组织学全切除，手术效果差，复发率高，预后差，死亡率高，而且对放化疗不敏感，传统药物因神经毒性和血脑屏障等因素，疗效不理想，导致恶性胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。因此，深入研究恶性胶质瘤的发病机制，寻找相关的恶性转化基因，实现重要靶向分子的特异性治疗和个体化治疗，是治疗恶性复发肿瘤的根本途径。邢变枝等[11]研究发现，在人脑胶质瘤中，Galectin-3的表达与肿瘤的WHO分级有关，可作为胶质瘤恶性程度分级的重要指标。李晓明等[12]将Galectin-3特异性siRNA转染人恶性胶质瘤细胞株U87MG，降低U87MG细胞Galectin-3蛋白的表达。结果发现，所构建的Galectin-3RNAi稳定细胞株在凋亡诱导剂的作用下，细胞凋亡率显著高于野生型细胞和转染空载体稳定细胞株(P<0.05);同样，在细胞增殖检测中，Galectin-3 RNAi稳定细胞株细胞增长率显著低于野生型细胞和转染空载体稳定细胞株(P<0.05)。上述结果说明，Galectin-3在恶性胶质瘤细胞U87 MG中起着抑制凋亡和促进细胞增殖的作用，Galectin-3应该成为该类肿瘤治疗的强有力的靶向基因和肿瘤个性化(肿瘤细胞中Galectin-3高表达)治疗的一种选择。

4.2 乳腺癌 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率逐年上升。在欧美国家，乳腺癌占女性恶性肿瘤的25%-30%。20世纪末的统计资料表明，全世界每年约有130万人诊断为乳腺癌，而有40万人死于该病。在我国许多大城市，乳腺癌发病率已经上升为女性恶性肿瘤的第一或第二位，死亡率占第四位或第五位，成为妇女健康的最大威胁。魏杨辉等[13]将设计并化学合成Galectin-3小干扰片段瞬时转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231，荧光倒置显微镜和实时定量PCR检测干扰结果，MTT法观察干扰后24、48、72、96h各组细胞增殖吸光度(A)值，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况，划痕实验和Transwell实验比较不同组间细胞迁移和侵袭情况。结论是RNA干扰能抑制Galectin-3的表达及MDA-MB-231细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，降低其迁移侵袭能力。

4.3 大肠癌 大肠癌是严重危害人类健康的常见消化道恶性肿瘤。近年来, 我国大肠癌的发病率及死亡率呈逐年上升的趋势, 在恶性肿瘤发病率中排第四位，而肿瘤转移是导致预后差和死亡的主要原因。因此，有效控制大肠癌的发展是患者长期生存的关键。张楠等[14]研究发现,Galectin -3蛋白在大肠癌组织、癌旁组织及腺瘤中的表达有明显差异;Galectin-3的表达与大肠癌组织的分化程度、浸润深度及发生淋巴结转移密切相关。Nakamura[15]研究发现，Galectin-3在大肠癌肝脏转移灶中的表达比大肠癌原发灶中的要高，两者表达均值相比具有统计学意义，提示Galectin-3在大肠癌肝转移中有重要作用。但也存在些不一致的结论，有报道认为结肠癌进展时Galectin-3表达增高[16]。也有研究发现，当结肠癌进展时其表达降低[17]。程变巧等[18]用Galectin-3 siRNA转染大肠癌细胞系LOVO细胞，检测Galectin-3低表达对细胞增殖与凋亡的影响，得到的结论是干扰后细胞增殖减慢,凋亡增加。

4.4 食管癌 石菲等[19]研究发现，Galectin-3蛋白在食管癌组织、正常食管组织中的表达具有明显差异(P<0.05)，Galectin-3 mRNA的阳性表达率在食管癌组织中明显升高，与食管癌的分化程度、浸润深度和淋巴结转移密切相关。这提示Galectin-3与食管癌的发生、发展及转移有关。邹国红等[20]将Galectin-3 siRNA转染食管癌Eca-109细胞后，用RT-PCR、MTT、流式细胞术和免疫细胞化学等方法分别检测转染效率、细胞增殖活性、细胞周期分布及Galectin-3、CyclinD1、p21、p27 蛋白的表达。结果发现，食管癌Eca-109细胞增殖活性明显减少，主要分布在G1期，CyclinD1和Galectin-3蛋白表达下降，p27和p21蛋白的表达升高。表明运用siRNA可有效抑制Galectin-3蛋白的表达及细胞增殖活性，Galectin-3参与食管癌Eca-109细胞株的增殖，与CyclinD1、p21、p27蛋白关系密切，Galectin-3可成为治疗食管癌的靶基因。

5 结语

Galectin-3对某些肿瘤的诊断、治疗和预后评价有重要意义。但是，Galectin-3的许多生物学功能和效应机制仍未完全清晰，利用RNAi技术可以有效抑制靶基因Galectin-3蛋白表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，Galectin-3可能成为治疗肿瘤细胞靶向治疗的新基因。

[1]Gong HC,Honjo Y,Nangia-Makker P,et al.The NH2 terminus of galectin-3 governs cellular compartmen-talization and functions in cancer cells[J].Cancer Res,1999,59(24):6239-6245.

[2]Honjo Y,Nangia-Makker P,Inohara H,et al.Down-regultion of Galectin-3 suppresses tumorigenicity of human breas carcinoma cells[J].Clin Cancer Res,2001,7(3):661-668.

[3]Choi JH,Chun KH, Raz A,et al.Inhibition of N-(4-hydroxyphenyl)retinamide-induced apoptosis in breast cancer cells by Galectin-3[J].Cancer Biol Ther,2004,3(5):447-452.

[4]Khaldoyanidi SK,Glinsky VV,Sikora L,et al.MDA-MB-435 human breast carcinoma cell homo and heterotypic adhesion under flow conditions is mediated in part by Thomsen-Friedenreich antigen-galectin-3 interactions[J].J Biol Chem,2003,278(6):4127-4134.

[5]Moiseeva EP,Javed Q,Spring EL,et al.Galectinn-1 is involved in vascular smooth muscle cell proliferation[J].Cardiovasc Res,2000,45(2):493-502.

[6]Yoshii T,Inohara H,Takenaka Y,et al.Galectin-3 maintains the transformed phenotype of hyroid papillary carcinoma cells[J].Int J Oncol,2001,18(4):787-792.

[7]Takenaka Y, Inohara H, Yoshii T, et al. Malignant transformation of thyroid follicular cells by galectin-3[J].Cancer Lett,2003,195(1):111-119.

[8]Camby I, Belot N, Rorive S, et al. Galectins are differentially expressed in supratentorial pilocytic astrocytomas,astro cytomas,anaplastic astrocytomas and glioblastomas,and significantly modulate tumor astrocyte migration[J].Brain Pathol,2001,11(1):12-26.

[9]Kaltner H, Seyrek K, Heck A, et al. Galectin-1 and galectin-3 in fetal development of bovine respiratory and digestive tracts.Comparison of cell type-specific expression profiles and subcellular localization[J].Cell Tissue Res,2002,307(1):35-46.

[10]Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and speci fi c genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391(6669):806-811.

[11]邢变枝,毛善平.Galectin-3在人脑星形胶质瘤细胞中的表达[J].卒中与神经疾病,2004,11(6):381-384.

[12]李晓明,朱廷准,梁国标.siRNA干扰半乳凝集素-3对恶性胶质瘤细胞株U87 MG细胞凋亡及增殖的影响[J].中华临床医师杂志(电子版),2012,6(22):7233-7237.

[13]魏杨辉,张宗明,杨莉涛,等.RNA干扰技术抑制Galectin-3表达对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖和凋亡的影响[J].安徽医科大学学报,2013,48(7):746-749.

[14]张楠,丁彦青,梁莉.Galectin-3在大肠癌组织中的表达及其临床意义[J].南方医科大学学报,2006,26(12):1685-1690.

[15]Nakamura M,Inufusa H,Adachi T,et al.Involvement of galectin-3 expression in colorectal cancer progression and metastasis[J].Int J Oncol,1999,15(1):143-148.

[16]Hittelet A,Legendre H,Nagy N,et al.Upregulation of galectins-1 and -3 in human colon cancer and their role in regulating cell migration[J].Int J Cancer,2003,103(3):379-379.

[17]Tsuboi K,Shimura T,Masuda N,et al.Galectin-3 expression in colorectal cancer: relation to invasion and metastasis[J].Anticancer Res,2007,27(4B):2289-2296.

[18]程变巧,耿炎,武金宝,等.利用RNA干扰技术抑制 Galectin-3的表达对人大肠癌细胞系LOVO增殖和凋亡的影响[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(16):3104-3107.

[19]石菲,彭贵勇,孙永刚,等.Galectin-3在食管癌中的表达及其临床意义[J].第三军医大学学报,2008,30(11):1062-1064.

[20]邹国红,孙军祥,苏正,等.siRNA干扰Gal-3对Eca-109食管癌细胞株CyclinD1、p21、 p27蛋白表达及细胞增殖的影响[J].河北医药,2012,34(17):2565-2567.