MicroRNAs在肾细胞癌中调控作用机制及应用

何 龙，高江平

解放军医学院 解放军总医院泌尿外科，北京 100853

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)简称肾癌，是一类起源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤[1]，我国肾癌的发病率估计为4/10万左右，高发年龄为60～70岁[2,3]。与许多其他恶性肿瘤一样，肾癌发病的早期无特异的临床症状，约1/3患者确诊时已发展为晚期，肾癌是对化疗药不敏感且极易发生耐药的恶性肿瘤，一般肿瘤化疗药物的有效率仅为7%～10%[4]。晚期转移性肾癌预后差，其中位生存期为6～12个月，5年生存率低于10%[5]。目前用于治疗转移性肾细胞癌的药物，主要针对的是血管生成因子和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路[6]，但其疗效有限。因此，在肾细胞癌的早期诊断上，临床上需要一种新的分子标志物，能够简便地进行风险评估，为患者选择更积极的治疗方式。miRNAs是由约22个核苷酸组成的非编码小RNA，它参与了许多细胞的生理病理过程[7]。miRNAs具有转录后调节功能，能调控信使RNA(mRNA)的翻译。目前的一些研究表明，miRNAs参与了许多与肾细胞癌相关的生物学过程[8]。本文对miRNAs在肾细胞癌的发病机制等方面的研究结果进行综述，探讨其作为新的诊断和预后标志物的可能性，以及如何将这些小分子作为肾癌生物治疗的最终靶点。

1 miRNAs与肾细胞癌病理生理过程的关联

1.1 调节机制 在多项研究中，通过人为干预调节miRNAs在肾细胞癌中的表达，发现miRNAs对异常细胞的作用是多种多样的。同一个miRNA可以针对多个mRNA，而多个miRNAs可以控制相同的分子，现在的结果尚难以准确地分析出单一miRNA对某个特定靶向基因及癌症的影响[9]。例如，miR-17-5p和miR-224靶向调节缺氧诱导因子1(HIF-1α)和VHL蛋白(Von Hippel- Landau protein)，使其在70%的肾细胞癌中呈现低表达水平[10]。此外，miR-17-5p的表达，与它的两个靶向基因，血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)和EGL9同源物3(EGL nine homolog 3,EGLN3)的表达呈负相关。对miR-224来说，其表达也同时与它的两个靶向基因—Smad4(Sma and Madrelated protein 4)和Smad5—的表达呈负相关。研究发现，相关致癌的miRNAs干扰与VHL-HIF-1α信号级联。例如，miR-92和VHL mRNA表达呈负相关[11]。在肾透明细胞癌中，miR-138靶向调节HIF-1α并抑制其表达，并进一步影响肿瘤细胞的凋亡和转移过程[12]。此外，HIF-1α的堆积与miR-210的上调有关。 miR-210的表达通过下调E2F转录因子3(E2F transcription factor 3，E2F3)来诱导中心体和DNA异倍体扩增，这种机制可能有助于肿瘤的发生和进展[13]。在另一项研究中，氨甲酰白蛋白—一种未知生物功能的蛋白代谢产物，被认为可能通过刺激miR-146a/b的表达参与了肾细胞癌的发病过程。虽然多数研究表明在肾细胞中miR-146a/b通常呈现高表达，但它们的具体作用机制尚不清楚[14]。

1.2 细胞增殖 细胞不受控制地生长是癌症的重要标志之一， 在一些肾细胞癌的研究中miRNAs已被证实能够改变细胞的增殖状态。例如，肿瘤抑制因子miR-1285在肾细胞癌中呈现低表达，并通过靶向基因转谷氨酰胺酶2(transglutaminase 2，TGM2)影响细胞的增殖[15]。miR-199a在59%的肾细胞癌中呈现低表达，调节miR-199a的表达能够下调糖原合酶激酶3b(glycogen synthase kinase 3b ，GSK3b)的表达。GSK3b是肾细胞癌的生长促进剂，miR-199a通过靶向调节GSK3b的表达抑制肾癌细胞的生长[16]。另一个参与细胞增殖过程的miRNA是miR-205，它在大部分肾细胞癌中呈现低表达。miR-205表达上调，通过靶向癌基因磷酸肉瘤(phospho-sarcoma，SRC)酪氨酸激酶，调节细胞外信号调节激酶1和2(extracellular signal-regulated kinase 1 and 2，ERK1 / 2)通路，抑制细胞增殖[17]。miR-21已被广泛证实是许多类型癌症的致癌基因，体外研究中，在多种肾癌细胞株中抑制其表达，均可表现出显著的抗增殖效应[18]。胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)是由几个miRNAs靶向调控的，VEGFA是miR-126的靶向基因。这两个因子是细胞增殖的正向调节因子，通过靶向调节其表达，可以影响这些肿瘤的生物学特性[19]。

1.3 细胞迁移和侵袭 癌基因TGM2在肾癌组织中广泛表达，是miR-1285的靶向基因，与细胞的迁移和侵袭相关[19]。miR-34a通过抑制骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(myelocytomatosis viral oncogene homolog，MYC)的表达，抑制MYCS-功能期激酶相关蛋白2(MYC S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)与Myc相关锌指蛋白1(Myc-associated zinc-finger protein 1，Miz1)结合，激活Ras同源基因家族因子A(Ras homolog gene family,member A,RhoA)与c-Myc阳性转录延伸因子b(c-Myc-positive transcription elongation factor,P-TEFb)结合，抑制肾癌细胞的侵袭[20]。57%不同表达的miRNAs拥有相同细胞簇的靶向基因，从而在转移性肾癌的进展过程中产生协同效应。VEGF、HIF-1α、血小板源性生长因子β(platelet-derived growth factor-beta，PDGF-β)、PDGFC、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP2)、双微体2同源基因(murine double mimute2，MDM2)和胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TYMS)，它们在转移性肾透明细胞癌中是多个miRNAs失调的协同靶向基因[19]。体内实验证实，miR-215的过度表达能够诱导细胞迁移和侵袭，这一过程是通过调节靶向调节蛋白锌指E盒结合同源盒蛋白2(zinc finger E box-binding homeobox 2，ZEB2)和上皮细胞-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)来影响肾癌细胞的转移潜能[21]。在肾癌组织中miR-708表达大多呈低水平，其靶向基因为ZEB2和多梳环指基因1(polycomb ring finger oncogene 1，BMI1)，这些蛋白通常在癌组织中呈现高表达，并可影响肿瘤细胞的上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)过程。miR-708通过对ZEB2和BMI1的调控来影响细胞的迁移和侵袭，同时诱导E-cadherin的表达和抑制纤维连接蛋白的表达[22]。

1.4 细胞凋亡和细胞周期 通过miR-199的过表达下调GSK3b的表达，抑制X染色体连接凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis,XIAP)和抗凋亡的B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤2(antiapoptotic B-cell chronic lymphatic leukemia/lymphoma 2，BCL-2)的表达水平，是由核因子-κ轻链增强活化B细胞介导的(nuclear factor kappa-light-chain enhancer of activated B-cells，NF -κB)[16]。重组miR-708表达能够通过裂解肾癌细胞株中的caspase-7和caspase-3诱导细胞凋亡，这一诱导过程是通过肿瘤坏死因子相关凋亡配体(NF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)的受体介导的。miR-708的促凋亡功能可能主要是通过介导细胞平衡调节器(survivin)，调节细胞死亡、细胞周期和细胞存活[22]。通过在肾癌细胞中调控miR-205的表达，来降低细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和c-Myc的表达水平，从而将细胞阻滞在G0/G1期，并诱导其凋亡[17]。在肾细胞癌中，miR-21的几个靶向基因在调节肿瘤进展过程中起着关键的作用，在体外研究中，通过细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1s(cyclin-dependent kinase inhibitor 1S，cdkn1s或P21)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的上调，以及细胞周期蛋白E2(cyclin E2)减少，抑制miR-21，使G0/G1期细胞比例增加。此外，减少miR-21的表达抑制肿瘤坏死因子受体超家族成员6(TNF receptor superfamily member 6，Fas)配体的表达和基质金属蛋白酶组织抑制因子3(tissue inhibitor of metalloproteinase 3，TIMP3)，从而提示miR-21的抗凋亡作用[18,23]。脯氨酸氧化酶(Proline oxidase，POX)是一种线粒体肿瘤抑制基因，通过线粒体产生的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和抑制HIF-1信号诱导细胞凋亡。在肾细胞癌中，POX很难被检测到，因为它是癌基因miR-23b的靶向基因，由于miR-23b的高表达抑制了POX的表达水平[24]。

2 miRNAs与肾癌诊断

由于临床影像技术的不断进步，越来越多的早期肾细胞癌被发现。然而，许多早期的肾细胞癌难以与非恶性肾脏病变区别，这可能会导致不正确的诊断结果和不必要的手术。肾细胞癌成功切除后，患者的术后监测主要依赖于影像技术和临床症状的评估，缺乏足够的特异性和敏感性。因此，为提高早期诊断的准确性以及预后评估的可靠性，临床上需要新的生物标志物作为早期诊断和疾病的复发或转移的肿瘤标志物。它能够在血液或尿液中被检测到，并具有较高的特异性和敏感性。miRNAs具有很大的潜力成为临床上可以运用的生物标志物，因为其在几种常见体液中的表达是稳定的，并且可以采用简易和相对便宜的标准定量逆转录聚合酶链反应法(standard quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction qRT-PCR)进行检测[25]。有研究已经对血清miRNAs水平在肾癌诊断中的意义进行探讨。例如，循环中的miR-1233可能作为肾细胞癌的潜在生物标志物，但目前的结果多数为病理标本中miR-1233的表达水平，与临床的关联有限[26]。肾癌亚型分类特性具有很高的临床重要性，因为各亚型有不同的预后和治疗方法[27]。在这种情况下，应该指出的是，基于miRNAs的表达和虚拟核型分析肾细胞癌的分类，能够使用少量的miRNAs区分最常见的四种类型成人肾肿瘤[28]。应用miRNAs标志物，与临床相结合，逐步建立诊断决策，鉴别肾细胞癌亚型之间(透明细胞，乳头状和嫌色细胞)和嗜酸细胞瘤。当形态学评估不足以进行诊断，采用该方法对小的活检样本进行诊断是非常有应用价值的[29]。在肾细胞癌中这种生物学标志物，包括影响转移发展的几个关键分子，有可能用于鉴别肿瘤是否具有高转移性，从而进一步指导正确的治疗方案[19]。作为诊断和治疗的常规组成部分，特异性的miRNAs表达谱可以提供更多个性化的治疗和靶向治疗。

3 miRNAs与肾癌预后评估

一些研究表明，miRNAs的异常表达与总生存期、疾病分期、肿瘤转移和复发的进展相关。例如，miR-21的表达与肾癌患者的总生存期呈负相关。miR-21的高表达与miR-199a的低表达一般与肾癌进展期相关[16,18]。同时，miR-9-1和miR-9-3都在肾细胞癌中表达显著下调。其编码基因的甲基化水平，在转移性肿瘤进展复发的病例中有较高的表达，并且高表达患者的无复发生存期少了近30个月[30]。另一个潜在的预后标志物是miR-708，它的靶向基因是Survivin，在肾细胞癌中，这是一个预测肾脏肿瘤进展和患者死亡的独立预测因子。此外，在转移的病例中，miR-106b表达明显下调，是肾脏肿瘤术后早期转移的预测标志物[22,31]。许多miRNAs可能作为肾癌预后的标志物，一些研究结果已在体外的肿瘤预测模型中进行了验证[32,33]，目前仍有必要进行更多的体内验证研究。

4 miRNAs与肾癌治疗

在肾细胞癌的发病机制研究中，发现了一些miRNAs的靶向因子，这种作用能让他们成为未来治疗的一个有益选择。不过，个别分子可以通过不同的miRNA靶向，单一的miRNA也可以通过相同的途径影响多个靶向基因，它可以提供新的治疗方案，但也增加了潜在的并发症。在肾细胞癌中，miR-224能同时调控两个转化生长因子β(transforming growth factor-beta，TGFβ)通路，即Smad4和Smad5。另一方面，miR-17-5p和 miR-224的靶向基因均是肿瘤抑制基因VHL和致癌基因HIF-1α[10]，这使得有时候靶向调控一定程度上失去了特异性。木黄酮类化学染料在体外和体内研究中都能降低miR-21的表达。对小鼠腹腔注射该类染料A-498能够使肾癌肿瘤减小[18]。miR-155可能是一种癌基因，它主要通过抑制碱性亮氨酸拉链转录因子1(inhibiting basic leucine zipper transcription factor 1，BACH1)使肾细胞产生异常分裂。因此，针对miR-155使用抗miRNA，可能成为一种新的肾细胞癌治疗方法[34]。上调miR-199靶向调节GSK3b，抑制癌细胞生长，因此，调控miR-199也可能成为一种新的治疗方法[16]。另外一项研究结果显示，对miR-205的表达进行干扰，能够抑制原致癌Src家族酪氨酸激酶(Src family tyrosine kinases，SFKs)的表达，从而抑制肾癌细胞的生长[17]。

5 结 语

miRNAs正在成为肿瘤诊断和分子生物治疗的重要一员，尽管目前对miRNAs调节通路的了解还不够，现有的研究结果显示，在肾癌肿瘤细胞中miRNAs具有调控作用，它们是肿瘤诊断、预后及治疗反应方面的一种有用的标记物。在已发表的miRNAs文献中应用的分析技术和方法不同，使得到数据的可比性受到了限制。为了将实验室的发现转化成临床应用的成果，必须考虑方法学方面的问题，包括组织保存、准备工作、分析方法的敏感性和特异性、各种方法稳定性方面的差异。另外，临床数据的有效性，需要通过多中心的更多样本研究证实。研究表明，在外周循环血检测到的miRNAs的表达具有肿瘤特异性。测量组织、血液、尿液样本中的miRNAs表达量，进行综合分析，并将它们作为生物标记物应用于临床诊断、预后评估及药物疗效等方面的研究中。同时，miRNAs在临床应用中的可靠性与传统的临床、病理和生化结果相比也更具优势。

原癌基因的控制或肿瘤抑制因子miRNAs能够协助调控肿瘤早期及进展期的发展。实验结果显示了miRNAs调控主要的路径，因此，有可能找到新的治疗靶点。然而，基于miRNAs治疗策略的研究仍处于初期，潜在治疗靶点的识别仍然是认识miRNAs功能的巨大挑战。在有效的肿瘤细胞转运系统中，治疗性的miRNAs以及非选择性的miRNAs的作用，可能带来潜在的副作用，阻碍其临床应用。尽管如此，目前的研究结论仍然揭示了miRNAs在肾癌诊治方面的潜能。因此，研究miRNAs对肿瘤细胞的调控，是未来肿瘤研究的发展方向。

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