便携式定量荧光免疫分析仪

谢梦圆,张 军,谷 稳，陈 哲，余健辉

(1.光电信息与传感技术广东普通高校重点实验室(暨南大学)，广东广州 510632；2.暨南大学光电工程系，广东广州 510632)

0 引言

C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是炎症患者血清中最常见的一种非抗体性蛋白质，通常健康人体中CRP浓度小于10 mg/L，然而在急性创伤、感染或其他炎症刺激反应后会快速增高几百倍[1-2]。常规CRP检测方法可在感染时检测出CRP>10 mg/L的浓度，若使用高敏感度分析法则可测得低浓度(0.1～10 mg/L)的CRP，称为hs-CRP(High-sensitivity CRP)。近年来许多研究表明，hs-CRP在健康者未来发生心血管疾病风险的评估上，是个独立且强有力的预测指标[3-10],其危险程度一般按照hs-CRP浓度<1 mg/L，1～3 mg/L，>3 mg/L由低到高分成3个等级[11-12]。在临床检测中，hs-CRP的检测精度达到0.3 mg/L即可接受，而检测稳定性C.V值应小于10%[13]。文中所研制的便携式定量荧光免疫分析仪采用荧光免疫分析技术与免疫层析技术相结合的检测方法，可以对人体血液中的CRP浓度进行高灵敏度的荧光定量检测，线性检测范围为1.00～27.00 mg/L，检测重复性好，仪器技术指标适用于临床免疫检测。

1 检测原理

该分析仪采用侧向层析、荧光示踪技术进行检测。测试过程中，首先将检测缓冲液(被荧光标记物标记的CRP抗体1)和血液样本混合，检测缓冲液中的CRP抗体1和血液中的CRP(抗原)反应形成抗原抗体复合物。当混合物样本被滴入试纸条的滴样孔内后，会迅速通过毛细作用在试纸条上泳动，CRP抗原抗体复合物被固定在检测带上的CRP抗体2所捕获，富集或截留在试纸条的检测带上，而游离的荧光标记物则会越过检测带富集在控制带处。血液样本中的CRP越多，检测带上的复合物积聚得越多，检测带上荧光物质的含量与CRP浓度有一定的对应关系。经定量荧光免疫分析仪扫描后，如果待测样本溶液中CRP含量低，则扫描处理后所得的荧光强度曲线如图1(a)所示；若待测样本溶液中CRP含量高，则扫描处理后所得的荧光强度曲线如图1(b)所示。经特定算法分析计算后得到一个无量纲的比值，参照标准浓度曲线就可以得到待测样本溶液的CRP浓度。

(a)

(b)图1 仪器检测原理

2 系统设计

便携式定量荧光免疫分析仪的总体方案是基于会聚光束扫描试纸条的检测方式进行设计的。以MSP430 F1611微处理器为核心，外围系统由光电检测模块、机械扫描平台及控制电路、ID 芯片、LCD液晶显示屏、RS232串行接口和键盘等组成，并可根据需要，选配微型打印机与上位机。仪器的硬件总体设计框图如图2所示。

图2 仪器总体框架设计

2.1 光电检测模块

光电检测模块包括光源及其驱动电路、滤光片、分光镜、聚焦/准直透镜、小孔光阑、光探测器等，模块示意图如图3所示。光电检测模块的主要功能是产生检测所需要的激发光，采集待测样本受激发出的荧光信号，并将其转为电信号输出。检测时光源点亮，激发光经准直镜准直后由45°放置的分光镜反射，再由聚焦/准直透镜聚焦到试纸条表面。此时，步进电机带动试纸条平稳移动。激发光扫描试纸条上的检测区域。试纸条上检测区域内的荧光物质被激发出的荧光由聚焦/准直透镜准直为平行光，经分光镜和截止滤波片滤除杂光，再由聚焦透镜聚焦在共聚焦小孔光阑上。通过光阑的光由光探测器探测并转换为电信号。该电信号经处理和分析计算后可转化为被测样本的浓度。

图3 光电检测模块

2.2 机械扫描模块

仪器通过软件控制机械扫描模块，配合光电检测模块实现对试纸条的扫描检测，基于特定算法对采集到的信息进行处理，计算出待测样本的浓度。

机械扫描模块主要包括步进电机(包含齿轮)及其驱动电路、运动平台两部分。运动平台包含滑块、尺皮带、导轨、试纸条槽板、定位装置等。滑块通过金属弹片与尺皮带相对固定，同时与试纸条槽板经螺丝固定，试纸条槽板嵌于导轨中。步进电机依托于运动平台，带动试纸条槽板中的试纸条往返运动。

2.3 控制与信息处理模块

分析仪的控制与信息处理模块包括2个功能，即仪器控制与数据处理。仪器控制主要负责激发光源的点亮与光源反馈电流信息处理、机械扫描平台的运动和数据采集等工作，以得到试纸条上荧光物质的分布曲线。数据处理完成滤波放大、智能选定检测带和控制带、计算并输出结果等功能。

便携式定量荧光免疫分析仪控制与信息处理模块功能以硬件为基础，通过软件运行来实现。软件系统包括上位机程序和下位机程序2部分。软件系统有2种工作模式：

(1)联机工作模式。这一工作模式主要运用于仪器出厂前性能调试、质控参数和标准曲线的设定、ID芯片匹配信息的写入以及室内的常规作业等。仪器通过RS232串行接口与计算机相连，受计算机控制，仪器键盘被锁定。此时计算机为上位机，仪器为下位机，是受上位机控制的一个子系统，操作指令由计算机发出。下位机能接受上位机的操作指令并反馈控制信号，实现数据的读入读出。上位机能将下位机采集的详细数据进行进一步的精确分析。

(2)独立工作模式。这一工作模式主要运用于仪器独立工作状态。该模式下仪器没有与计算机相连，仪器通过键盘操作独立工作，用户可根据屏幕提示对日期、测试编号等参数进行设定。仪器采集的数据经处理分析后，将相关信息通过LCD显示屏反馈给用户，并可连接打印机将测试结果打印输出。

3 性能测试

3.1 线性范围检测

在1.00～27.00 mg/L的试剂浓度范围内，每隔3 mg/L选取一个浓度水平的同一荧光试剂进行测试分析(其中前2个浓度相差2 mg/L，共10种浓度)，每种浓度水平测试3次取平均值为最终结果。对测得的结果进行线性回归分析，其线性回归拟合曲线如图4所示，所得的线性回归方程为：

y=0.996x+0.119

(1)

其中相关系数R2=0.999 9，以上结果表明仪器在1.00～27.00 mg/L浓度范围内具有良好的线性响应特性。

图4 线性回归拟合曲线

3.2 重复性测试

(2)

(3)

式中S为标准差。

测试所得结果见图5，3组数据的变异系数C.V值均< 7.00%，优于仪器设计要求的重复性变异系数C.V值≤10.00%(2.00～20.00 mg/L)，表明仪器具有良好的测量重复性。

图5 重复性测试结果

3.3 最低检测浓度测试

配制0.75 mg/L、0.50 mg/L、0.35 mg/L、0.25 mg/L 4个浓度水平的样本分别测试10次，分析计算其变异系数C.V值。由于低浓度样品检测时容易产生误差，因此这里选取C.V值≤20%的测量值中可检测的最低浓度作为该仪器的最低检测浓度。

测试结果如图6所示，由数据可以推断，仪器的最低检测浓度在 0.35～0.50 mg/L区间内。由于现有实验条件的限制，若配置浓度在0.35～0.50 mg/L内的样本，误差较大，因此以样本浓度理论值为X坐标，以变异系数C.V值为Y坐标，利用多项式回归分析，找出最适合回归方程，进而计算出最低检测浓度。图6中的曲线为多项式回归结果，其中一阶回归方程、二阶回归方程的相关系数R2分别为0.824 2和0.918 3，而三阶回归方程可与测试数据完全拟合，即最优拟合曲线方程为三阶多项式方程。由该方程可计算得出，y不大于20时的x最小值为0.36 mg/L，即仪器的最低检测浓度为0.36 mg/L。

图6 样本浓度与变异系数多项式回归方程拟合曲线

4 结束语

文中介绍了一种便携式定量荧光免疫分析仪，该仪器CRP浓度的线性检测范围为1.00～27.00 mg/L,CRP浓度的检测重复性变异系数C.V值 < 7.00%(2.00～20.00 mg/L)，CRP的最低检测浓度为0.36 mg/L，仪器性能稳定，技术参数符合临床免疫检测的要求，可广泛应用于现场定量检测。

参考文献：

[1] CLYNE B,OLSHAKER J.The c-reactive protein.The Journal of Emergency Medicine,1999,17(6):1019-1025.

[2] 简序，王金和.C 反应蛋白的临床研究进展.国外医学临床生物化学与检验学分册，2004，25(5)：471-473.

[3] PRADHAN A D,MANSON J E,RIFAI N,et al.C-reactive protein,interleukin 6,and tisk of developing type 2 diabetes mellitus.The Journal of the American Medical Association,2001,286(3):327-334.

[4] 杨俊娟，祖凌云,孟磊，等.C反应蛋白与冠心病危险因素及冠状动脉病变的相关分析.中国介入心脏病学杂志，2002，10(1)：25-27.

[5] FREEMAN D J,NORRIE J,CASLAKE M J,et al.C-reactive protein is an independent predictor of risk for the development of diabetes in the west of scotland coronary prevention study.Diabetes,2002,51(5):1596-1600.

[6] RIDKER P M,CUSHMAN M,STAMPFER M J,et al.Inflammation,aspirin,and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men.The New England Journal of Medicine,1997,336(14):973-979.

[7] 王秀艳，袁建新，王轶瑾，等.血清超敏C反应蛋白与急性脑梗死的相关性研究.临床神经病学杂志，2006，19(3)：210-212.

[8] 周熙琳，陈德生，周柱玉.老年高血压患者颈动脉粥样硬化与血清超敏 C 反应蛋白水平的相关性分析.临床医学，2009，29(8)：89-90.

[9] 吴寿岭，王娜，赵海燕，等.高敏 C 反应蛋白对高血压前期人群进展至高血压的预测价值.中华高血压杂志，2010，18(4)：390-394.

[10] RIDKER P M,BURING J E,SHIH J.Prospective study of C-reactive protein and the risk of future cardiovascular events among apparently healthy women.Circulation,1998,98(8):731-733.

[11] YEH E T H,WILLERSON J T.Coming of age of C-reactive protein:using inflammation markers in cardiology.Circulation,2003,107(3):370-371.

[12〗 LEVINSON S S.Brief review and critical examination of the use of hs-CRP for cardiac risk assessment with the conclusion that it is premature to use this test.Clinica Chimica Acta,2005,356(1-2):1-8.

[13] PEARSON T A,MENSAH G A,ALEXANDER R W,et al.Markers of inflammation and cardiovascular disease.Circulation,2003,107(3):499-511.