康氏木霉HEX1蛋白的原核表达及纯化

唐 俊，陆 娟，许惠芬，陈 捷

(1 阜阳师范学院 生命科学学院，安徽 阜阳 236037；2 上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240；3 山东省淄博市桓台县林业局，山东 淄博 256400)

HEX1蛋白是构成伏鲁宁体(Woronin body)的主要蛋白[1]，伏鲁宁体是丝状真菌特有的细胞器，是一种特化的过氧化物酶体，位于细胞边缘或菌丝隔膜孔附近[2-3]，其功能是在细胞受损时保持细胞结构的完整性，例如通过封堵菌丝细胞隔膜孔，防止菌丝细胞质外渗[4-6]。到目前为止，粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)[2]、瑞氏木霉菌(Trichodermareesei)[7]、稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)[8]、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)[5]等真菌的hex1基因均已被分离出来。部分真菌hex1基因的功能研究已较为深入，如粗糙脉孢菌hex1基因的敲除，可以导致细胞裂解后原生质的外泄，表明在胁迫条件下该基因通过封闭隔膜孔，防止细胞质大量损失[2]。Soundararajan等[4]研究表明，稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)缺失hex1基因后，菌丝细胞形态发生变化，附着胞侵染能力或定殖寄主植物细胞的能力下降，稻瘟病菌的致病能力降低。本课题组前期研究表明，敌敌畏胁迫条件下木霉菌HEX1蛋白表达量明显上调，并据此推测hex1基因可能通过调控木霉菌菌丝的隔膜系统，增强其耐受敌敌畏胁迫的能力[9]。Curach等[7]成功克隆出了瑞氏木霉菌(Trichodermareesei)的hex1基因，分析了其基本的分子特性。但有关hex1基因在木霉中的重要功能研究较少。因此，本研究对康氏木霉(Trichodermaknoningii)的HEX1蛋白进行原核表达及纯化，以期为进一步研究hex1基因在木霉中的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株及质粒 康氏木霉菌株T30、E.coliBL21(DE3)菌株、质粒pET-28a(+)，均由上海交通大学环境微生物实验室保存。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ、T4DNA连接酶、PCR反应相关试剂、反转录试剂盒及TA克隆试剂盒，均购于Takara公司；RNA提取试剂盒购于Invitrogen公司；质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒，购于上海捷瑞生物工程有限公司；抗His标签的兔多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG、二氨基联苯胺(DAB)、镍柱亲和层析试剂盒，均购于上海业力生物科技有限公司。

1.2 hex1基因的克隆

1.2.1 引物设计及合成 根据GenBank中发布的康氏木霉hex1序列(登录号：HM156671)，设计针对HEX1蛋白基因的特异性引物，上游引物为T30expF：GCGGATCCATGGGTTACTACGAC(下划线为BamHⅠ酶切位点)，下游引物为T30expR：GAGAAGCTTTTACAGGCGAGAGC(下划线为Hind Ⅲ酶切位点)。引物由上海博尚生物有限公司合成。

1.2.2 RNA提取 康氏木霉菌丝经过滤、水洗抽干后，液氮研磨成粉末，加入Trizol溶液混匀，具体提取方法参照Trizol试剂(Invitrogen公司)说明进行。

1.2.3hex1基因的RT-PCR扩增 参考RT-PCR试剂盒(Takara公司)进行cDNA第1链合成。反转录体系10 μL： 5×PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScriptRTEnzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol/L) 0.5 μL，总RNA样品500 ng，最后加无RNase水补足至10 μL。混匀后于37 ℃水浴15 min，85 ℃热变性5 s。以合成的cDNA为模板，PCR扩增hex1基因。PCR反应体系25 μL：cDNA模板2 μL，premixTaqTM(2×)(Takara公司)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL，最后加灭菌ddH2O补足至25 μL。扩增程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共28个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 pMD19-T-hex1的构建及鉴定 将纯化的PCR产物与pMD19-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取pMD19-T-hex1质粒并经BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切鉴定正确后，送上海博尚生物有限公司测序，以进一步确认序列，从而得到重组克隆质粒pMD19-T-hex1。

1.3 HEX1蛋白的原核表达及分析

1.3.1 原核重组表达质粒的构建 用BamHⅠ和Hind Ⅲ 对pMD19-T-hex1质粒进行双酶切，收集酶切产物，并与同样用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切的pET28a(+)载体连接，连接产物转化E.coliDH5α，在含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板上筛选阳性克隆，提取重组质粒pET28a-hex1，并经酶切和PCR测序验证，确保hex1原核表达框完全正确。

1.3.2 重组蛋白的诱导表达及纯化 1)重组HEX1蛋白的诱导表达及可溶性分析。将重组质粒pET28a-hex1转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，通过菌落PCR进行阳性克隆验证。将含重组质粒的BL21(DE3)菌株接种于5 mL液体LB培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中，于37 ℃培养过夜。次日按培养基体积1%的接种量转接于新鲜液体LB培养基(含50 μg/mL卡那霉素)中扩大培养至OD600约为0.6，然后加入终浓度分别为0.2,0.6和1.0 mmol/L的IPTG，以未加IPTG为对照。37 ℃继续培养3 和6 h后，分别取1 mL菌液进行SDS-PAGE电泳，确定最佳IPTG诱导浓度和诱导时间。同时设空载体表达菌为阴性对照(CK)。

IPTG诱导6 h后，6 000 r/min离心10 min收集菌体。将菌体重悬于PBS缓冲液(pH 8.0)，冰上放置30 min，然后加入终浓度为1 mmol/L的PMSF超声波破碎处理15 min (破碎6 s,间歇10 s，功率300 W)，12 000 r/min冷冻离心10 min。离心后分别收集上清液和沉淀，进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的可溶性。

2)重组HEX1蛋白的纯化及鉴定。转接100 μLE.coliBL21(含重组质粒pET28a-hex1)菌液到2个250 mL LB液体选择培养基中，37 ℃、200 r/min 过夜培养。第2天，将过夜培养的250 mL菌液等分成2份(即250 mL菌液与等体积培养基均匀混合后再分成2瓶)，37 ℃、200 r/min培养至OD600为0.6～0.8，1.0 mmol/L IPTG诱导6 h。用400 mL离心管收集菌体，6 000 r/min离心5 min，弃上清。沉淀用40 mL Lysis buffer(pH 8.0)溶液吹打散开。超声处理20 s，停20 s，共50次，功率400 W。将超声后的菌悬液于4 ℃、12 000 r/min离心10 min。弃上清，沉淀用20 mL含8 mol/L尿素的Lysis buffer(pH 8.0)溶液重悬，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min。收集上清，采用镍柱亲和层析试剂盒纯化重组蛋白。

用Western blot方法鉴定纯化的重组蛋白。通过湿转法将SDS-PAGE凝胶上的重组蛋白转移到PVDF膜上。再用质量分数5%脱脂牛奶于室温封闭3 h。封闭结束后，将膜转移至一抗孵育盒(1∶5 000 稀释)中，室温孵育3 h后，用1×TBS缓冲液洗3次，每次5 min。再将膜转移至二抗孵育盒中(1∶3 000稀释)，室温孵育1 h后，用1×TBS缓冲液洗3次，每次5 min。最后，将膜放在DAB显色液中5 min，出现条带后，放入去离子水中终止反应。

2 结果与分析

2.1 hex1基因的扩增及pMD19-T-hex1质粒的鉴定

通过RT-PCR扩增得到大小为660 bp的康氏木霉HEX1蛋白基因特异片段，将目的片段与载体pMD19-T连接，获得重组表达载体，经双酶切鉴定，获得了大小约为2 700 bp和660 bp的2条DNA条带(图1)，与预期大小一致，表明目的基因已经成功克隆并连接到载体上。

2.2 重组表达质粒pET28a-hex1的鉴定

用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切pMD19-T-hex1质粒，将酶切产物与同样用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切的pET28a(+)载体连接，对酶切检验正确的重组质粒pET28a-hex1进一步测序，发现hex1原核表达框完全正确。

图1 重组质粒pMD19-T-hex1的双酶切鉴定

2.3 重组HEX1蛋白的诱导表达及可溶性分析

SDS-PAGE电泳结果表明，随着IPTG诱导时间的延长，目标蛋白的表达量增加(图2)，而含空载体质粒和未经过IPTG诱导的大肠杆菌均未见目标蛋白的表达。终浓度分别为0.2,0.6和1.0 mmol/L的IPTG诱导表达的HEX1蛋白量无明显差异；但随着诱导时间的延长，重组蛋白表达量明显提高。IPTG诱导6 h的蛋白量明显多于3 h。因此，用 1.0 mmol/L IPTG诱导6 h进行后续试验。

菌体经IPTG诱导培养，超声波破碎处理后分别收集上清液(含可溶性蛋白)和沉淀(含不溶性蛋白)，SDS-PAGE电泳检测结果发现，表达出的蛋白主要在沉淀中，上清液中未见明显的蛋白表达(图3)。

2.4 重组HEX1蛋白的纯化及鉴定

将目的蛋白通过IPTG诱导大量表达，超声破碎菌体，尿素变性沉淀蛋白再经镍柱亲和层析纯化。样品与镍柱充分混合后，首先用洗脱缓冲液洗去大部分杂质蛋白，再用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液洗去非特异性结合蛋白，最终获得了纯化的HEX1蛋白(图3)。

含有重组质粒pET28a-hex1的E.coliBL21菌株在37 ℃条件下，经1 mmol/L IPTG诱导6 h，再将不同样品蛋白经SDS-PAGE电泳分离，将蛋白质转移到PVDF膜上后，以抗His标签的兔多克隆抗体为一抗、HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，检测目标蛋白。结果(图4)显示，对照样品没有出现杂交条带，而全蛋白和沉淀蛋白中均有明显的杂交条带，表明HEX1蛋白成功表达，并主要在沉淀蛋白中以包涵体的形式呈现。

图2 经不同浓度IPTG诱导3 和6 h HEX1蛋白的表达

图3 重组HEX1蛋白在E.coli BL21中的诱导表达

图4 重组HEX1蛋白的Western blot分析

3 讨 论

对部分真菌HEX1蛋白的氨基酸编码序列进行比较发现，在不同的丝状真菌中HEX1蛋白具有同源性，暗示伏鲁宁体的核心组成成分和功能在进化上是保守的[5]。本研究克隆了康氏木霉hex1基因的cDNA序列，并成功地在原核细胞中表达和纯化了HEX1蛋白，这将为其他种属木霉的hex1基因表达和蛋白纯化提供借鉴。

在原核细胞中进行蛋白融合表达时，诱导温度、时间及IPTG的浓度均会影响蛋白的表达效果。许多蛋白的高水平表达往往会形成包涵体[10]。本试验中融合表达的蛋白就是以包涵体形式存在的，需要经尿素变性溶解。对细菌细胞进行裂解的方法有很多，包括液氮冻融法[11]、超声波破碎法[12-13]及SDS裂解[14]等。本试验用超声波破碎法提取蛋白，经SDS-PAGE分析，表明超声波破碎法能够有效裂解细胞。在后续研究中，可以进一步优化重组质粒的表达条件，降低蛋白在细胞内的合成速度和合成量，以使重组蛋白能够正确折叠，形成正确的构象并分泌到胞外。

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