中华圆田螺抗氧化-代谢酶系统对转cry1Ab/Ac基因抗虫水稻的响应

谭树华，刘雨芳,*，孙远东，肖璐，李菲，桂芳艳，刘文海，戈峰

1. 湖南科技大学生命科学学院 园艺作物病虫害治理湖南省重点实验室，湘潭411201 2. 中国科学院动物研究所，北京100101

水稻是受害虫侵袭最为严重的粮食作物，选育抗虫水稻是防治害虫最经济有效的方法。目前,应用于植物抗虫性改良的外源基因主要是编码苏云金芽孢杆菌(Bacillusthringiensis)杀虫晶体蛋白基因(Bt基因)，已获得的转Bt抗虫植物有水稻、玉米、棉花、番茄等50 多种，其中转Bt棉花在我国已大面积种植[1]。已有大量研究报道转Bt水稻对靶标害虫有显著的杀虫效果[2-5]，对土壤微生物组成及酶活性[6]、稻田节肢动物群落多样性[7,8]、非靶标生物[9,10]没有明显影响。转cry1Ab/cry1Ac融合Bt基因水稻华恢 1号(HH1)作为首批获得农业部批准安全证书(农基安证字(2009)第072号)的转基因水稻品种，对其生态安全性评价虽已有初步研究：如HH1对二化螟有较强致死力[11]、对白符跳(Folsomiacandida)存活率和繁殖率[12]与根际土壤微生物数量和种类没有明显影响[13]。这些均无例外地集中在转Bt水稻对靶标害虫杀虫有效性与对土壤生物、节肢动物的安全性评价，尚未涉及水环境中的生物安全影响评价，不利于从整体全面评价其生态安全。

中华圆田螺(Cipangopaludinacathayensis)俗称田螺，是淡水腹足类中的优势种群，也是南方稻田中常见的底栖软体动物，分布广、生长迅速、食物类型多样，能以各种藻类、水生植物、浮游植物、水体有机碎屑为食，也食轮虫、微生物、水蚤、剑蚤等浮游动物。它能积累用常规方法检测不出的底泥或水中污染物,是多种污染物的生物积累者, 是环境监测的理想生物种类[14,15]。它们在水中移动性小, 可以真实地反映周围底泥的实际污染状况[16]，是一种理想的底泥重金属毒性和生物可给性指示生物[17]。据报道，田螺肝胰脏CAT活性的变化可作为间接检测环境的污染程度的指标[18]。因此，本实验以中华圆田螺为对象，探讨转基因水稻对水生环境中软体动物抗氧化-代谢酶系统的影响，旨为转基因水稻对水生生态系统的影响研究积累数据，为转基因水稻的全面生态风险评价提供科学依据。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 实验材料与试验设计

水稻品种：供试转Bt基因水稻品种为转cry1Ab/Ac复合基因抗虫水稻恢复系华恢1号(HH1)，以其亲本非转基因品种明恢63(MH63)为对照，稻种均由华中农业大学生命科学技术学院相关实验室提供。

田间种植设计：于2012年6月至9月单季种植于湖南湘潭的项目实验基地内，手工单本移栽，试验田1 530 m2,间隔为 9个小区，每小区面积170 m2,并随机相间分成3组，每组3小区(3次重复)。其中1组种植华恢1号(HH1)，全生育期不施任何化学杀虫剂；另外2组均种植非转基因水稻明恢63，其中1组全生育期不施任何化学杀虫剂，为阴性对照(MH63)，另1组稻田则按当地生产用药习惯喷施农药作为阳性对照(MH63C)。水肥管理相同且均按常规生产操作。

MH63C组施药：全生育期施药3次，7月2日施用阿维菌素、纹曲清与吡虫啉；7月21日施用阿维菌素2%、水胺硫磷35%、甲硫乙唑醇27%、曹达5 s与吡蚜酮25%；8月12日施用阿维菌素2%、丙溴辛硫磷25%、速虱灵30%与噻嗪酮25%。施用方法均按说明常规混合施用。

指示动物：以中华圆田螺为实验检测指示动物，均采自湘乡市东郊乡稻田及相邻水沟，挑选螺龄相近、体重约2.5 g的健康个体于室内驯养后用于实验。在稻田平整后水稻移栽前，每小区稻田中以对角线法设置样方池3个(长×宽=50 cm ×100 cm)，样方间距约8 m，将池内泥清空置入尼龙纱网框后，再将泥回填并使纱网高出水面上20 cm防逃。水稻移栽后每样方池中接入田螺20只，水稻收割前10 d全部捡出回收，用于室内生理生化指标测定。

1.2 田螺组织匀浆液制备

将回收的田螺每组随机取5只，解剖取其肝脏和鳃，用0.86% 预冷生理盐水分别制成10%的肝、鳃组织匀浆液，检测各处理组田螺肝、鳃中的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)、谷胱甘肽-S转移酶(GST)、还原型谷胱甘肽(GSH)与谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)活性。

1.3 检测方法

SOD 用邻苯三酚自氧化法[19]测定,CAT 活性用紫外分光光度法[20]测定,ACP用对硝基酚磷酸法[20]测定，SOD、CAT与ACP的酶活性单位均为U·mg-1pro。GST 活力用CDNB 比色法[21]测定，GSH含量、GSH-PX 活性用南京建成生物公司相应试剂盒测定。酶液蛋白质含量以牛血清蛋白为标准物,考马斯亮蓝法测定[22],单位为mg·mL-1。

1.4 数据处理

实验数据分析用SPSS17.0统计软件完成，采用单因素方差分析(ANOVA)、S-N-K、LSD 法进行多重比较检验与差异显著性分析。

2 结果(Results)

2.1 中华圆田螺的SOD响应

分别生长在Bt稻华恢1号(HH1)、非Bt稻明恢63(MH63)及施药的非Bt稻明恢63(MH63C)3类稻田生境中的中华圆田螺肝脏与鳃SOD活性如图1所示。HH1生境与MH63C生境中中华圆田螺肝脏SOD活性明显高于MH63生境，且以HH1生境中SOD活性最高。与对照MH63稻田生境相比，其SOD活性为HH1组极显著高于MH63组(p<0.01)，MH63C组显著高于MH63组(p<0.05)；其中HH1组SOD活性较MH63组增加了111.95%、MH63C组较MH63组增加了41.40%，但HH1组仅稍高于MH63C组，差异不显著(p>0.05)。

与肝脏SOD活性表现不同，鳃SOD活性MH63C组略高于HH1组与MH63组，但MH63组和MH63C组、HH1和MH63C组以及HH1组与MH63组间均无显著差异(p>0.05)。

2.2 中华圆田螺的CAT响应

3种稻田生境中中华圆田螺CAT活性关系见图2。其中鳃CAT活性太低，未能检出。HH1与MH63C生境中中华圆田螺肝脏中SOD活性均极显著高于MH63生境(p<0.01)，且以HH1生境中CAT活性最高，MH63C组次之，但HH1与MH63C组之间CAT活性差异不显著。与对照MH63稻田生境相比，HH1和MH63C生境组肝脏CAT活性分别提高了2.513倍和1.357倍。

图1 不同稻田生境中中华圆田螺SOD活性比较注：** p<0. 01, 下同。Fig. 1 Comparision the activities of SOD of Cipangopaludina cathayensis in different rice fields Note: ** p<0. 01, Same for below

图2 不同稻田生境中中华圆田螺CAT活性比较Fig. 2 Comparision the activities of CAT of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields

2.3 中华圆田螺的GSH-Px响应

田螺肝脏中GSH-Px活性以HH1组最高，MH63组次之，MH63C组最低，但经多重比较与差异显著性分析，彼此之间均未出现显著差异(p>0.05)；鳃中GSH-Px活性以MH63C组最高，HH1最低，且MH63C组极显著高于HH1和MH63组(p<0. 01)，而HH1与MH63之间GSH-Px活性差异不显著(p>0.05)(图3)。

2.4 中华圆田螺的GSH响应

GSH含量比较如图4所示，HH1和MH63C生境中田螺肝脏GSH含量略高于MH63组，但均无显著差异(p>0.05)。与对照组MH63比较，MH63C组田螺鳃GSH含量是MH63组的GSH含量的1.69倍，差异显著(p<0.05)，而HH1组田螺鳃GSH含量略低于MH63C组，略高于MH63组，但均无显著差异。

图3 不同稻田生境中中华圆田螺肝脏GSH-Px活性Fig. 3 The activities of GSH-Px of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields

图4 不同稻田中中华圆田螺GSH含量注：*p<0. 05Fig. 4 The GSH content of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields Note: * p<0. 05

2.5 中华圆田螺的ACP响应

HH1生境中田螺肝脏ACP活性均极显著高于MH63和MH63C组(p<0.01)。HH1生境组肝脏ACP活性较MH63和MH63C生境组分别提高了112.4%和98.8%，而MH63C和MH63组活性则差异不明显。鳃ACP活性以MH63C组最高，HH1次之，对照MH63生境组最低，但3种生境中田螺鳃ACP活性差异不显著(p>0.05)(图5)。

图5 不同稻田中中华圆田螺ACP活性Fig. 5 The activities of ACP of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields

2.6 中华圆田螺的GST活性响应

MH63C生境中田螺肝脏GST活性最高，极显著高于MH63和HH1生境组(p<0.01)，其中MH63C组较MH63组GST活性提高了66.16%，而HH1和MH63组间活性差异不显著(p>0.05)。与肝脏GST活性表现相似，鳃GST活性以MH63C组最高，MH63C组鳃GST活性分别是HH1组与对照MH63组活性的1.7倍与2.02倍，差异极显著(p<0.01)；HH1组鳃GST活性略高于MH63组，但无显著差异(p>0.05)(图6)。

图6 不同稻田中中华圆田螺GST活性Fig. 6 The activities of GST of Cipangopaludina cathayensis in 3 different rice fields

3 讨论(Discussion)

GSH和GST在生物的解毒代谢中发挥重要作用，GSH为GSH-Px和GST 的特有底物，GST催化GSH与一些化学物质和亲电子化合物结合, 生成无毒性或毒性小的GSH 硫结合物；同时能催化有机过氧化物还原成相应的醇,与硒谷胱甘肽过氧化物酶(Se-GPx)协同作用起抗氧化作用，从而减少这些物质与细胞内生物大分子结合的可能性，减少有害物质对组织的损伤[24]。熊燕飞等[25]报道转Bt基因杂交水稻汕优63配制的饲料对昆明种雄性小白鼠体内的保护酶和解毒酶活性影响不明显,转基因水稻对昆明种雄性小白鼠的生理代谢无明显副作用。本实验中生长在HH1和MH63稻田生境中的中华圆田螺肝组织匀浆液中GSH含量和GST酶活性差异不显著，表明中华圆田螺通过提升抗氧化酶活性对多余的氧自由基进行有效清除，因而解毒代谢相关酶GST活性和GSH含量变化不明显，说明HH1号产生的Bt毒蛋白对田螺没有明显的毒副作用。

ACP是巨噬细胞溶酶体的标志酶，与机体物质代谢关系密切，它通过催化磷蛋白中磷酯键的水解，直接参与磷酸基团的转移和代谢，在免疫反应中发挥重要作用，并可被外源物质诱导[26]。俞超等[27]报道转Bt基因水稻在种子萌发和幼苗抗逆性以及水稻的生长能力等方面都要优于原亲本，其淀粉酶和过氧化氢酶含量及根系活力均高于对照秀水11。HH1稻田生境中中华圆田螺肝脏ACP酶活性显著高于MH63稻田生境对照组，表明HH1号稻田生境中中华圆田螺DNA、蛋白质和脂质代谢能力明显增强，与其抗氧化能力显著提高相类似，可能与肝脏作为主要的解毒器官和脂肪代谢场所，其抗氧化酶和代谢酶类活性通常较高有关。与肝脏组织匀浆液中所测的各类酶活性情况不同，HH1号生境中中华圆田螺鳃组织匀浆液中所测的各类酶活性与对照组MH63生境比较，均无显著差异，说明HH1对中华圆田螺鳃组织没有明显毒副作用。

施用杀虫剂明显激活中华圆田螺肝脏和鳃中抗氧化酶系统和解毒代谢酶活性，MH63C组田螺解毒代谢酶活性明显高于HH1组，说明Bt毒蛋白对田螺的影响明显弱于杀虫剂产生的胁迫作用。采用转Bt基因水稻防治害虫对环境生物的毒性影响更小。与Bt水稻对稻田节肢动物群落的影响明显弱于化学杀虫剂的研究相似[28]。MH63C和MH63生境中田螺ACP活性并未表现出明显差异，则与农药作为强毒性化学物质主要产生毒性作用，因而主要影响解毒代谢酶有关。

转Bt基因作物的大部分 Bt 毒素可通过根系分泌物、花粉飘落及作物残体释放到农田土壤中[29]，Bt毒蛋白质分子所带电荷或极性基团，会借助于静电引力吸附到土壤表面上相应的阳离子或阴离子基团上，这种结合态仍有较强的杀虫活性并能抵抗土壤微生物的降解[30]，土壤中的水稻植株残体内的Cry1Ab可持续作用于土壤微生物、土壤动物与土壤酶等[31-34]。同时，转Bt作物中Bt杀虫蛋白的表达及在环境中的降解存在时空动态[35]，因而在其周围环境传递过程中也可能存在时空动态。在后续研究中可综合考虑，以便为更全面充分地评价转Bt基因水稻的安全性提供更多信息。

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