基于荧光光谱检测不同环境牛奶中维生素B2含量研究

2014-03-25杨苗张伟刚杨萍果

山西农业大学学报（自然科学版） 2014年3期

杨苗,张伟刚,杨萍果

(1.山西农业大学文理学院,山西太谷 030801；2.南开大学现代光学研究所光电信息技术科学教育部重点实验室，天津 300071； 3.山西师范大学生命科学院，山西临汾 041000)

维生素B2(Vitamin B2)，是人体内许多重要酶的组成成分，但在人体内含量很少，而人体自身又无法合成该化合物，必须从食物中摄取。VB2能促进发育和细胞再生，保证皮肤、指甲、毛发的正常生长，帮助消除口腔、唇、舌的炎症，增进视力，减轻眼睛的疲劳，帮助碳水化合物、脂肪、蛋白质代谢等。因此，它在人体的生长、发育及代谢过程中发挥着不可替代的重要作用。人体中缺乏维生素B2会引起多种疾病。

牛奶是人们日常生活中最喜爱的食物之一，含有丰富的蛋白质、脂肪、钙、维生素等多种营养成分。早在上世纪30年代化学家哥尔倍格从牛奶中提取VB2，在2年后由化学家哥恩合成。目前维生素B2含量的研究方法主要有高效液相色谱法[1,2]、荧光分析法[3,4]、电化学法[5]等。不同的检测方法各有优缺点，如高效液相色谱法对高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析有优势，但该方法的缺点是有“柱外效应”。在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间(进样器、柱接头、连接管和检测池等)中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。电化学法的缺点是电极选择性不高，易发生副反应，降低电流效率，电极易形成吸附层和氧化膜，污损电极使电压升高。

荧光分析法具有灵敏度高、干扰少、线性范围宽、选择性好、样品用量少、操作简便等优点,被广泛用于食品[1,2，6～9]、药品[3，5，7]及环境[4]等领域的检测，是一种有效的光谱分析技术。刘杰等[10]采用激光诱导荧光(LIF)技术研究鲜牛奶变质过程，发现牛奶的荧光光谱与其变质过程有密切的关系；顾春峰[8]等连续几天对不同牧场合格奶样的三维荧光光谱分析，发现荧光光谱可区分不同牧场来源的奶样，判断该牧场的奶样是否稳定，但采用荧光光谱技术对牛奶中维生素B2的成分检测报道很少。本文采用荧光光谱技术分析法研究不同环境(酸、碱、光照、温度)对纯牛奶中维生素B2含量的影响，为从牛奶中摄取VB2提供理论参考。

1 荧光产生的原理

大多数分子在室温时均处在电子基态的最低振动能级，当物质分子吸收了与它所具有的特征频率相一致的光子时，由原来的能级跃迁至第一电子激发态或第二电子激发态中各个不同振动能级(图1)。其后，大多数分子常迅速降落至第一电子激发态的最低振动能级，在这一过程中它们和周围的同类分子或其他分子撞击而消耗了能量，因而不发射光。分子在第一电子激发态的最低振动能级停留约10～9 s之后,直接下降至电子基态的各个不同振动能级，并以光的形式释放出多余的能量，所发生的光即是荧光(图1)。某些荧光物质分子在降落到第一电子激发态的最低振动能级后，通过另一次无辐射跃迁降落至亚稳的三重线态，又受到热激活作用再回到第一电子激发态的各个振动能级，最后由第一电子激发态的最低振动能级降落至电子基态而发出荧光。因此，产生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有能吸收激发光的结构，通常是共轭双键结构；第二个条件是该分子必须具有一定程度的荧光效率。

2 试验及方法

2.1 试验样品

试验用鲜牛奶购于山西农业大学牧站牛奶厂；生物试剂维生素B2(VB2)、蒸馏水、盐酸(HCl)、氢氧化钠(NaOH)均购于天津市光复精细化工研究所；1 cm比色皿。

图1 荧光光谱能级跃迁Fig.1 Fluorescence spectrum energy level transition

2.2 试验仪器

采用日本岛津RF-5301PC荧光分光光度计，以150 W的弧光氙灯作为发光光源，用1300刻线·毫米-1的光栅作为单色仪中分光元件，采用R3788型光电倍增管(PTM)作为光电探测器，扫描波长范围为220～900 nm，波长精度为±1.5 nm，波长扫描速度3000 min-1，可通过500～650 nm的滤光片作为畅通滤光片,测得的数据经RF-5301软件实时采集、处理并输出。

电子天平为上海精科FA1204B型，精度为0.1 mg。

2.3 样品的制备

2.3.1 维生素B2标准储备液配制

准确称取维生素B2对照样品10 mg，用0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解维生素B2，定容至100 mL的棕色容量瓶中，其浓度为0.10 mg·mL-1，当天配置，冰箱4℃保存，试验时稀释成不同的浓度的标准系列。

2.3.2 不同环境下牛奶中维生素B2液体的配制

2.3.2.1 配制酸性环境下牛奶中维生素B2的液体样品

取10 mL鲜牛奶4份，分别加入5 mL浓度不同的(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L-1)盐酸溶液提取，超声提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，经0.3 μm有机微孔滤膜抽滤后，去部分上清液待进行光谱测定。

2.3.2.2 配制碱性环境下牛奶中维生素B2的液体样品

取10 mL鲜牛奶4份，分别加入5 mL浓度不同的(0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mol·L-1)氢氧化钠溶液提取，超声提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，经0.3 μm有机微孔滤膜抽滤后，去部分上清液待进行光谱测定。

2.3.2.3 在不同时间的光照环境下牛奶中维生素B2的液体样品

取10 mL鲜牛奶4份，分别在阳光下照射5、10、15、20、25 h，然后超声提取30 min后，定容至25 mL的容量瓶中，经0.3 μm有机微孔滤膜抽滤后，去部分上清液待进行光谱测定。

2.3.2.4 不同温度下牛奶中维生素B2的液体样品

取10 mL鲜牛奶4份，分别在20、40、60、80、100℃的水浴中放置3 h，超声提取30 min后定容至25 mL的容量瓶中，经0.3 μm有机微孔滤膜抽滤后，去部分上清液待进行光谱测定。

3 荧光光谱数据处理

3.1 激发波长与发射波长的选择

维生素B2标准制备液在不同的激发波长照射下，产生的荧光光谱强度(I)随着激发光波长的增加而增加，对应的荧光光谱的波段为500～610 nm。由图2可见，当激发光波长为370 nm时，荧光光谱中出现荧光强度最高的峰对应的峰值波长是530 nm。可以断定维生素B2溶液的最佳激发波长(λex)为370 nm，最佳发射波长(λem)为530 nm。

图2 维生素B2标准制备液的荧光光谱Fig.2 Fluoresecence spectra of aqueou solution of Vitamin B2

图3 牛奶的荧光光谱Fig.3 Fluoresecence spectra of Mike

3.2 酸处理对牛奶中维生素B2含量的影响

由图4可见，随着盐酸浓度的增加，VB2的含量略有下降，表明盐酸对牛奶中维生素B2的含量的影响较小，牛奶中维生素B2在酸性环境下较稳定。维生素B2在酸性环境下，产生了p-π共轭作用，增强了π电子共轭程度，使最低激发单重态与基态之间的跃迁几率增大，使荧光增强。

3.3 碱处理对牛奶中维生素B2含量的影响

由图5可见，随着氢氧化钠浓度的增加，维生素B2的含量逐渐下降，表明氢氧化钠对牛奶中VB2的含量影响较大，牛奶中维生素B2在碱性条件下不稳定，易被分解破坏。其原因主要是减少了π电子的共轭度，同时增加了分子的内转换和系间跨越过程以及分子内部的振动等非辐射跃迁的能量损失，减弱了荧光效率。分子结构刚性减弱，共平面性减弱，荧光减弱。因此，随着过氧化氢浓度的增加，过氧化氢的氧化性增强，将VB2氧化为其他物质，致使牛奶中维生素B2的含量有所下降。

图4 不同HCL浓度下牛奶中维生素B2的含量Fig.4 Vitamin B2concentration of Mike of different HCL concentration

图5 不同NaOH浓度下牛奶中维生素B2的含量Fig.5 Vitamin B2concentration of Mike of different NaOH concentration

3.4 光照条件对牛奶中维生素B2含量的影响

由图6可见，随着光照时间的延长，牛奶中VB2的含量逐渐下降，说明光照对牛奶中VB2的含量影响较大，即VB2对光敏感，易被分解破坏，物质分子吸收辐射后，物质分子的荧光产率必然由激发态分子之活化过程的各个相对速率决定。随着光照时间的延长，一个原因是分子内部能量转化。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量。另一个原因是碰撞频率增加，使外转换的去活几率增加。导致荧光强度减小。因此，牛奶要避光保存。

图6 光照下牛奶中维生素B2的含量Fig.6 Vitamin B2concentration of Mike of Light time

3.5 温度对牛奶中维生素B2含量的影响

由图7可见，随着温度的升高，牛奶中VB2的含量渐有下降，说明温度对牛奶中VB2的含量影响不大，即VB2对温度不敏感。这主要是由于随着温度的升高，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将减小，原因是分子内部能量转化。当激发分子接受额外热能时，有可能使激发能转换为基态的振动能量，随后迅速振动弛豫而丧失振动能量，导致VB2的含量减少。因此，温度因素对牛奶的保存影响不太显著。