PPVS-1A株保存期研究及免疫原性测定

张婉华,朱永军,张春玲,何锡忠,彭丽英

(上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106)

根据《兽药注册办法》和农业部442号、683公告精神[1～3]，兽用生物制品制造所用种毒应经过系统的鉴定，具有良好的免疫原性的繁殖特性，并具有明确的生物学特性和鉴别特性等。疫苗生产所用种毒，不仅直接影响到疫苗的质量，而且关系到人畜的健康与安全，只有经过检验合格的种毒，才可用于生产兽用生物制品。

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病因之一，可引起母猪尤其是初产母猪的繁殖障碍，表现为母猪受胎率降低，产活仔数减少和(或)出现死胎、木乃伊胎等[4]。目前预防该病的主要措施是疫苗预防接种。猪细小病毒病活疫苗具有良好的安全性和免疫效果，为了确保疫苗的质量，生产用种毒的稳定性至关重要，本试验对PPVS-1A株湿毒和冻干毒在-20℃和-70℃经不同时间保存后，对其进行了病毒含量、血凝价、安全性和免疫原性的检测。

1 材料与方法

1.1 ST细胞

由上海市农业科学院畜牧兽医研究所提供。

1.2 血清与培养基

新生牛血清和MEM粉，均由美国GIBCO公司生产。

1.3 试验动物

2～4日龄健康乳鼠(每窝不少于5只，带母鼠饲养)、300～500 g健康青年豚鼠(HI抗体效价≤1∶8)，均购自中国科学院上海实验动物中心。

1.4 病毒含量测定

用细胞营养液将病毒液作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、 10-8、10-9等6个稀释度，分别接种长势良好的ST细胞(96孔细胞培养板)，每个稀释度接种4孔，每孔0.1 mL，同时设细胞阴性对照孔。接种后，置37℃、含5%CO2培养箱培养7 d，观察细胞病变(CPE)，出现CPE者判为感染，计算TCID50。样品TCID50应基本保持稳定，无明显变化。

1.5 HA和HI试验

参照文献[5]。样品的HA、HI应基本保持稳定，无明显变化。

1.6 种毒的安全检验

每一样品接种乳鼠一窝，皮下注射0.1 mL，观察7 d，记录乳鼠健活情况。乳鼠接种后应不出现种毒注射导致的不良反应。

1.7 种毒的免疫原性试验

每一样品接种豚鼠5只，每只肌肉注射0.1 mL，同时设对照组，接种后21 d，全部采血，检测猪细小病毒HI抗体效价。接种豚鼠后至少4只HI抗体不低于1∶32，对照组HI抗体应全部不高于1∶8。

1.8 病毒

猪细小病毒PPVS-1A F10湿毒和冻干毒，由上海市农业科学院畜牧兽医研究所提供。PPVS-1A F10湿毒和冻干毒分别放置在-20℃和-70℃保存，每12个月取样一次，每一样品测定TCID50、HA，并将每一样品接种乳鼠和豚鼠，观察种毒的安全性和免疫原性。

2 结果与分析

2.1 PPVS-1A株湿毒的保存期及免疫原性试验

由表1可见，在-20℃保存24个月和-70℃保存48个月，每一样品其病毒含量在107.25～107.75，HA血凝价在1∶1024；乳鼠安全检验均健活，未见不良反应；豚鼠抗体检测时，HI均不低于1∶32。而-20℃保存36个月和-70℃保存60个月，HA血凝价或豚鼠抗体效价检测有所下降。

表1 PPVS-1A 株湿毒在不同温度下保存的测定结果

注：“-”表示HI抗体效价≤1∶8，表2同。

Note：“-” indicates antibody titer of HI ≤1∶8.The same as table 2.

2.2 PPVS-1A株冻干毒的保存期及免疫原性试验

由表2可见，在-20℃保存36个月和-70℃保存60个月，每一样品其病毒含量和红细胞凝集价均无明显变化，病毒含量在107.25～107.75，HA血凝价1∶1024；乳鼠安全检验均健活，未见不良反应；豚鼠抗体检测时，HI均不低于1∶32。而-20℃保存48个月和-70℃保存72个月，HA血凝价或豚鼠抗体效价检测有所下降。

表2 PPVS-1A 株冻干毒在不同温度下保存的测定结果

3 结论与讨论

为了防治动物疾病，促进养殖业的健康发展，维护人体健康，农业部加强了兽用生物制品的管理，于2004年11月农业部发布了第44号令《兽药注册办法》[3]，2004年12月农业部发布了第442号公告《兽用生物制品注册分类及注册资料要求》，2006年6月发布了683号公告《兽用生物制品试验研究技术指导原则》，对兽用生物制品所用的菌种有明确的要求，根据公告要求，本试验进行了种毒保存期试验，从源头上保障猪细小病毒病疫苗的产品质量。

猪细小病毒病活疫苗生产用种毒PPVS-1A株湿毒在-20℃保存24个月、冻干毒保存36个月，湿毒在-70℃保存48个月、冻干毒保存60个月，病毒含量均大于107.25，HA血凝价在1∶1024；乳鼠接种未见不良反应；豚鼠抗体检测HI均不低于1∶32。PPVS-1A株的病毒含量、血凝价、毒力及免疫原性均比较稳定，为疫苗的生产质量奠定了良好的基础。

猪细小病毒用本动物——猪做效力试验，价格昂贵，并需要一定的隔离饲养条件，费时费力，用实验动物豚鼠替代猪，作为本试验的效力检验，取得了理想的效果，且豚鼠作为猪细小病毒效力检验的实验动物已得到证实[6,7]。作为生物制品研究与生产的重要原材料，种毒无论在新兽药证书申报材料中还是对已有产品的GMP车间验收中都作为一项重要指标[8]。本研究证明猪细小病毒病活疫苗生产用种毒PPVS-1A株，具有良好的安全性和免疫原性，可用于疫苗制备。

参 考 文 献

[1]中华人民共和国农业部.兽用生物制品试验研究技术指导原则[S].中华人民共和国农业部公告第683号，2006.

[2]中华人民共和国农业部.兽用生物制品注册分类及注册资料要求[S].中华人民共和国农业部公告第442号，2004.

[3]中华人民共和国农业部.兽药注册办法[S].中华人民共和国农业部令第44号，2004.

[4]殷震，刘景华．动物病毒学(第2版)[M]．北京：科学出版社，1997：1150-1158.

[5]张婉华，邹勇，朱永军，等.猪细小病毒HA、HI微量法试验的优化[J].中国兽药杂志，2013，47(2)：21-23.

[6]张婉华，叶向阳，徐平，等.用豚鼠效检猪细小病毒病油乳剂灭活疫苗判断标准的初步研究[J].上海农业学报，2004，20(1):120-122.

[7]盘宝进，白安斌，姚瑞英，等.豚鼠对猪细小病毒弱毒苗抗体反应的研究[J].中国预防兽医学报，2002，24(6)：467-470.

[8]中华人民共和国农业部畜牧兽医局.兽药生产质量管理规范培训指南[M]．北京：中国农业出版社，2002：413.