重组白细胞介素-2高效纯化方法建立

王坤，李海涛，张润祥，朱言柱，刘艳环，冯卓，苗利光

(中国农业科学院特产研究所，长春130112)

白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)是一种具有广泛生物活性的细胞因子，是由位于第4号染色体上的单个基因编码的一种单链多肽分子，分子质量为15 500，由133个氨基酸组成。IL-2肽链上第58位、第105位是半胱氨酸(Cys)残基，经翻译、加工后形成二硫键及第3位苏氨酸(Thr)的糖基化，其中二硫键对于活性的保持具有重要的作用[1]。IL-2在机体免疫应答中具有重要作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤及改善和提高机体免疫功能的作用。可提高人体对病毒、细菌、原虫等感染的免疫应答，增强清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等的能力[2]。在临床上，应用IL-2有许多副作用，常见有发烧、肌肉痛、寒战、呕吐、腹泻等流感样症状。另外，还观察到呼吸困难、肾功能效率不足、消化道紊乱、血压降低、冷漠、疲倦或皮损等症状[3]。

本实验依据人白细胞介素-2(hIL-2)副作用与分子表面结合CD25结合有关[4]的机理，在不改变hIL-2空间结构的基础上优化hIL-2的氨基酸序列，使修饰后的hIL-2(mhIL-2)蛋白失去了与CD25亚基结合的能力[5]。利用工程技术制备出mhIL-2。分别制备出不同缓冲体系及缓冲液，通过离子交换法和凝胶过滤法捕获和纯化mhIL-2，筛选出纯化mhIL-2的最佳方法。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

1.1.1试剂mhIL-2冻干粉(中国农业科学院特产研究所经济动物疫病研究室制备)；广谱彩虹预染蛋白Marker(北京康为世纪生物科技有限公司)；十二烷基磺酸钠(Sigma公司)；hIL-2 Elisa kit(上海卓康生物科技有限公司)；其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.2仪器YXQ-SG46-280S型手提式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；Centifuge 5415R型低温冷冻离心机(EPPENDORF公司)；AKTA Purifier 10蛋白纯化系统(美国GE Healthcare公司)；ALPHA2-4LP Plus型冷冻干燥机(CHRIST公司)；SHZ-82型恒温振荡器(常州国华电器有限公司)；Mini-PROTEAN Tetra型电泳系统、ChemiDoc XRS+型分子成像系统(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1离子交换法分别配制各个缓冲体系的结合液和洗脱液，即A液和B液。乙酸钠-乙酸缓冲体系(A液0.05mol/L乙酸钠，乙酸调至pH 4.0；B液为A液中加入1mol/L NaCl)；柠檬酸钠-柠檬酸缓冲体系(A液为0.02mol/L柠檬酸钠，用柠檬酸调至pH 4.0；B液为A液中加入1mol/L NaCl)；甲酸钠-甲酸缓冲体系(A液0.05mol/L甲酸钠，用甲酸调至pH 4.0；B液为A液中加入1mol/L NaCl)。

所有缓冲液经过0.45μm滤膜过滤、脱气后备用。分别用各缓冲体系的A液溶解冻干样品，用A液平衡管道，弱阳离子交换柱Sepharose Fast Flow室温放置30min后连接蛋白纯化仪，柱子平衡好后紫外调零注射器加样；用B液将穿透峰洗回基线；收集器收集洗脱峰。

1.2.2凝胶过滤法第1种缓冲液(0.02mol/L乙酸钠、0.001mol/L MgCl2、10%甘油，用乙酸调至pH 3.7)；第2种缓冲液(0.02mol/L乙酸钠、0.1mol/L NaCl、3%甘油，用乙酸调至pH 3.7)；第3种缓冲液(0.02mol/L乙酸钠、0.001mol/L MgCl2，用乙酸调至pH 3.7)。

所有缓冲液经过0.45μm滤膜过滤、脱气后备用；缓冲液平衡管道，将凝胶过滤柱G-50室温放置30min后连接蛋白纯化仪，柱子平衡好后紫外调零，注射器加样；收集器收集蛋白峰。

1.2.3SDS-PAGE电泳样品纯化后进行SDS-PAGE电泳。配制15%分离胶、5%浓缩胶。电泳条件50V/胶 30min，90V/胶，恒流；染色液(0.25% G-250、45%甲醇、10%乙酸)；脱色液(45%甲醇、10%乙酸)。染色过夜后脱色至背景清楚，使用凝胶成像系统对凝胶进行观察分析。

1.2.4mhIL-2浓度测定采用hIL-2 Elisa kit测定mhIL-2浓度。标准品浓度分别为15pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1 000pg/mL。将纯化的mhIL-2 10倍倍比稀释，与标准品一起进行测定，450nm处读取各样本的OD值。具体试验步骤参考试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 离子交换法捕获目的蛋白

注射器加样1mL，B液100%洗脱2min。mhIL-2在粗品中所占百分比固定、捕获蛋白占总蛋白比例高的方法效果最好。试验结果表明，乙酸钠-乙酸缓冲体系洗脱峰与穿透峰比值高，捕获效果最好，见图1～图3。

1.穿透峰；2.洗脱峰 1.penetration peaks;2.elution peak

1.穿透峰；2.洗脱峰 1.penetration peaks;2.elution peak

1.穿透峰；2.洗脱峰 1.penetration peaks；2.elution peak

2.2 凝胶过滤法精纯目的蛋白

选择最佳缓冲体系纯化的目的蛋白进行凝胶过滤，结果表明，第1种缓冲液中盐与蛋白质无法分离；第2种缓冲液虽可以分离，但是分离效果较差，蛋白峰和盐峰不能完全分开；第3种缓冲液可以完全分开，见图4～图6。

1.盐峰；2.蛋白峰 1.salt peaks;2.protein peaks

1.盐峰；2.蛋白峰 1.salt peaks;2.protein peaks

2.3 SDS-PAGE电泳检测mhIL-2纯度

分别经乙酸钠-乙酸缓冲体系离子交换法和第3种缓冲液凝胶过滤脱盐后的纯品进行SDS-PAGE电泳检测，得到单一的蛋白条带，大小为15Ku左右。与目的蛋白大小相符。见图7。

2.4 mhIL-2浓度检测

以标准品浓度为横坐标、450nm下读取的各检测孔OD值作为纵坐标绘制标准曲线图，并得出方程y=3E-0.6X2-0.005X+2.276，R2=0.999。根据标准曲线方程和目的蛋白的OD值计算出mhIL-2的浓度为0.49mg/mL。见表1、图8。

3 讨论

本实验采用简单、高效的离子交换法捕获目的蛋白，由于重组IL-2 PI约为5，所以选择弱阳离子交换柱Sepharose Fast Flow。缓冲液pH对离子交换的成功非常重要，缓冲液缓冲范围的pH和样品的PI值应相差1～2纯化效果最好，所以试验缓冲液pH值为4最佳。

1.盐峰；2.蛋白峰 1.salt peaks;2.protein peaks

M.蛋白质预染MarKer；1.纯化样品M.Plus prestained protein ladder;1.purified sample

图8 hIL-2 Elisa标准曲线

表1Elisa法测定mhIL-2浓度

Table1ThedetectionofmhIL-2concentrationbyElisa

标准品 StandardmhIL-2浓度(pg/mL)15501002505001000XOD1.1531.0250.8420.5710.1890.1010.612

凝胶过滤法中柱子的选择以目的蛋白分子质量为基础，pH 3.7的缓冲液相对碱性蛋白质更容易脱盐，精细纯化目的蛋白。纯化蛋白如不长期保存，可在第3种脱盐缓冲液加入减弱蛋白甘油，使之和柱床非特异性结合。本研究筛选的纯化方法简单、高效，易于大规模生产。

[1]常瑞雪,颜天华,王秋娟,等.白细胞介素-2及其相关药物的应用研究进展[J].药学进展,2011,(1):1-7.

[2]高晋.重组人白介素-2的纯化工艺研究[D].长春:吉林大学,2012:54.

[3]Whittington R.,D.Faulds.Interleukin-2.A review of its pharmacological properties and therapeutic use in patients with cancer[J].Drugs,1993,46(3):446-514.

[4]Epstein AL,Mizokami MM,Jiali Li,et al.Identification of a protein fragment of interleukin 2 responsible for vasopermeability[J].J Natl Cancer Inst,2003,95(10):741-749.

[5]王松.CD25结合位点修饰性hIL-2在毕赤酵母中的表达及活性鉴定[D].北京:中国农业科学院，2012：60.