肠黏膜免疫屏障及其保护措施

谢天宇 胡红莲 高 民*

我们通常所说的肠道屏障功能主要是依靠肠黏膜屏障功能来实现的，肠黏膜不仅是动物机体重要的消化吸收场所，同时也是抵御毒性大分子、防止机体感染的重要局部部位。正常情况下，肠黏膜处于低渗状态，肠黏膜上皮细胞的紧密连接结构状态和肠道相关淋巴组织(gut－associated lymphoid tissue，GALT)的免疫防护作用可有效地阻止大分子物质通过，尤其是抑制细菌、毒素等通过肠黏膜向机体内部扩散的途径。但是肠黏膜屏障在受损时就会为细菌、组胺和内毒素等有害物质吸收入血提供通道，尤其是内毒素，其吸收入血会产生一系列的放大反应，轻则引起炎性反应、黏膜感染，重则导致动物多器官和系统性损伤，甚至导致机体不可抑制性的炎症反应，进而危及生命［1］。肠黏膜屏障主要包括机械屏障、生物屏障、化学屏障以及免疫屏障［2］，本文主要对肠黏膜免疫屏障的功能特点、免疫机制以及保护性措施进行综述。

1 肠黏膜免疫屏障的结构特点和免疫机制

1.1 肠黏膜免疫屏障的结构特点

肠黏膜免疫屏障是迄今为止动物和人类最重要的屏障之一［3－4］。肠黏膜免疫是区别于动物整体免疫系统的局部免疫，主要在抗原的刺激下产生局部的免疫反应，中和抗原物质，以避免机体本身受到损害。肠黏膜免疫屏障主要由GALT及其分泌的分泌型免疫球蛋白A(secreted immunoglobulin A，sIgA)、细胞因子等免疫生成物质构成。GALT 包括派伊氏结(peyer’s patch，PP)、黏膜淋巴集合体、弥散黏膜淋巴组织以及免疫细胞，其中免疫细胞包含肠上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)、上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte，IEL)和固有层淋巴细胞(lamina proprial lymphocyte，LPL)等。

1.2 肠黏膜免疫屏障的免疫机制

肠黏膜免疫屏障主要是由摄取、递呈、处理抗原的诱导部位免疫细胞和发生免疫反应的效应部位免疫细胞共同发挥免疫功能构成的独立免疫体系，其以sIgA介导的体液免疫为主，细胞毒性介导的细胞免疫为辅。

肠黏膜免疫应答是免疫系统的特殊免疫细胞对于潜在危害病原进行识别及处理的过程。首先，诱导免疫细胞，如PP内的微褶皱细胞(microfold cell，M细胞)选择性接触、黏附、摄取外部抗原，将抗原吞噬并转运至胞膜另一侧递呈给抗原递呈细胞(antigen－presenting cell，APC)，再进一步将其释放到肠黏膜固有层和皮下;其次，进入黏膜固有层及皮下的抗原刺激效应部位免疫细胞IEL、LPL，进而带动一系列效应免疫反应。IEL绝大多数为分化抗原簇(cluster of differentiation，CD)3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞，以CD8+T细胞为主，可直接识别未加工的抗原，具有自然杀伤性(NK)细胞活性，同时释放细胞因子。LPL主要包括T细胞、B细胞、杀伤(K)细胞、NK细胞、巨噬细胞(macrophages，mø)、肥大细胞(mall cell，MC)和树突状细胞(dendritic cell，DC)等，以CD4+T细胞为主。通常情况下，GALT中CD4+/CD8+是检验动物机体肠道免疫功能正常与否的重要指标之一。固有层中存在两种相互协同的免疫方式，即:1)固有层中的大量CD4+T细胞分泌细胞因子，下调免疫反应;2)致敏后转移的B细胞在固有层中同型转换成免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)A，IgA产生后被释放到浆膜细胞外侧，与黏膜上皮细胞分泌片段结合形成复合物sIgA，最终分泌于黏膜或浆膜表面，从而发挥免疫效应。目前，以sIgA和细胞因子主导的肠黏膜免疫机制是免疫学研究的2大重点。

1.2.1 sIgA主导肠黏膜免疫功能的正常发挥

大多数病菌利用宿主肠黏膜表面作为入侵感染的第1个入口［5－6］，而以 sIgA 为主的体液免疫在肠黏膜免疫系统中起主导作用，是阻止病菌在肠黏膜黏附和定植的重要防御前线［7］。sIgA是肠黏膜免疫屏障最主要的体液免疫防御因子，能包裹外来病菌，封闭病菌与IEC的特异结合位点，使其丧失吸附于IEC的黏附能力，这是避免细菌移位途径的重要依赖方式。作为肠黏膜免疫屏障的主要效应因子，sIgA不仅可阻止肠黏膜上皮细胞对细菌、毒素和其他有害分子的识别及摄取，并借助肠道机械蠕动清除病原体和毒素，还能减弱外部抗原刺激所引起的全身性免疫反应即免疫耐受的形成，阻止肠黏膜免疫屏障系统对肠道共栖的有益菌群产生免疫应答［8］。研究表明，适当的sIgA免疫应答对于维持肠道内环境稳态、降低细菌引起的炎症反应以及调控过敏反应等起着重要作用，同时肠道菌群的平衡程度也可反作用于sIgA，调节其分泌释放。值得注意的是，sIgA介导的肠黏膜免疫应答在很大程度上依赖于GALT的T细胞和白细胞介素(interleukin，IL)－4、IL－6、转化生长因子(transforming growth factor，TGF)－β 等细胞因子的参与。

IgA蛋白水解酶作为水解sIgA的关键水解蛋白酶，具有水解sIgA、抑制细胞凋亡、刺激促炎症因子释放和诱导T细胞特异性反应等特殊作用以及其他潜在疾病治疗等多方面免疫功能，从而受到广泛关注。因此，对于肠黏膜IgA和sIgA的研究，有必要继续探究IgA蛋白水解酶的致病机理和生物学性能，同时有关于IgA、IgA蛋白水解酶、IgA蛋白酶水解抑制因子3者之间详细的互作关系亦有待进一步研究。

1.2.2 细胞因子对肠黏膜免疫屏障的关键性调节作用

在肠黏膜免疫系统被激活时，活化的免疫细胞释放细胞因子，介导免疫应答、炎症反应的效应分子，能在局部作用于特定的免疫细胞以发挥免疫效应，同时还能影响动物机体神经、内分泌等非免疫组织，在许多生理、病理过程中发挥重要作用。

肠黏膜免疫屏障可产生多种细胞因子，包括淋巴因子、趋势化细胞因子、生长因子(GF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)等，目前研究较多的是炎性细胞因子(IL－2、IFN－γ、TNF－α)和抗炎性因子(IL－4、IL－5、IL－10)等。IL－2主要在于肠黏膜固有层中由T辅助细胞1(T helper cell 1，Th－1)产生，与sIgA一样属于分泌型免疫分子，可诱导调节T细胞、B细胞的生长分化，激活NK细胞，促进IgA的分泌，参与淋巴细胞归巢，介导炎症反应和创伤愈合，是具有明显的免疫增强和免疫治疗作用的免疫调节因子。IFN－γ对IgA的分泌起抑制或下调作用，还可与其他细胞因子联合作用，影响紧密连接蛋白基因表达，并参与肠黏膜细胞介导的免疫。TNF－α主要来源于巨噬细胞，能与其他细胞因子和相应的介质受体结合引起细胞凋亡和细胞因子的瀑布式释放从而进一步影响黏膜免疫效应;IL－4、IL－5等细胞因子由T辅助细胞 2(T helper cell 2，Th－2)产生，对 IgA 免疫反应有明显增强作用。IL－10是一种免疫调节性细胞因子，可限制和终止炎症反应、调解多种免疫细胞的分化增殖、防止过度免疫应答所造成的损害［9］，并在一定程度上影响紧密连接蛋白的表达，保证小肠上皮完整性。另外，一些趋势化细胞因子如胸腺表达趋势化细胞因子(TECK)、黏膜相关上皮趋势化细胞因子(MEC)等在对淋巴细胞、DC、NK细胞的吸引作用以及抗炎症反应等方面发挥明显的上调免疫反应作用。诸多细胞因子的免疫作用机制和治疗潜力对于开发免疫增强性疫苗、研究动物免疫疾病意义重大。

2 肠黏膜免疫屏障的保护性措施

鉴于肠黏膜免疫屏障对动物机体免疫健康影响意义重大，因此关于肠黏膜免疫屏障功能的调节与保护有必要进行深入研究，以下是常见的黏膜免疫屏障的调节保护性措施。

2.1 益生菌

肠道栖息着数量巨大的菌群，作为肠黏膜的潜在致病性抗原，不仅时刻威胁肠黏膜，还对黏膜免疫屏障具有明显的刺激作用。肠道菌群影响黏膜免疫抗原提呈通路的活化［10］、sIgA和细胞因子的生成以及免疫应答的激活等。现阶段，益生菌制剂的添加应用是维持肠道菌群平衡、改善肠黏膜免疫屏障功能最有效的保护措施之一。

益生菌是一群可以在胃肠道内定植的有益微生物群落，主要包括乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌、芽孢杆菌等，不仅可有效地维持肠道内菌群平衡，即抑制病原菌在肠道的黏附定植和腐败菌的过度生长、促进有益菌生长，还能与肠黏膜共同构成一道屏障，增强肠黏膜紧密连接蛋白的表达，并对于sIgA、细胞因子、肠黏膜淋巴细胞都有明显的调节作用，具有明显的维护正常肠道菌群环境、优化肠黏膜免疫系统、预防和治疗特殊病理状况的多重保护菌株特性。Yang等［11］在用芽孢杆菌、布拉氏酵母菌和嗜酸性乳酸杆菌的混合益生菌灌喂蛋鸡的试验中发现，益生菌可显著提高肠液中IgA的含量，IgA、IgM和IgG生成细胞数量也有显著增加趋势，同时伴有盲肠段T细胞数量的显著增加。研究显示，益生菌存在着通过多类型抗原识别受体 Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)、髓样分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)信号转导途径、MyD88非依赖途径来影响肠黏膜免疫屏障功能的先天免疫防御机制［12］，并对肠炎、过敏性皮肤炎、风湿性关节炎的实验小动物诱导产生积极的免疫效果。Galdeano等［13］在用益生菌干酪乳杆菌灌注小鼠诱导激活肠黏膜免疫的试验中发现，连续灌服后，试验组小鼠小肠中CD206+细胞数量与对照组相比显著增加且固有层中Toll样受体2(TLR－2)基因表达水平显著上调，IgA数量和IL－6生成细胞数量在灌注后期与对照组相比有明显的增加趋势。

2.2 饲粮调控

肠道是营养物质消化吸收的主要场所，动物机体肠内和肠外的特定营养状态很大程度上影响肠黏膜免疫屏障功能，适当调控饲粮营养因子水平是维持正常肠内营养供给、保证肠黏膜免疫屏障功能的最重要且最常见的调节、保护性措施，主要包括补饲精氨酸(arginine，Arg)、谷氨酰胺(glutamine，Gln)及锌(Zn)、硒(Se)和维生素 A 等微量元素。

2.2.1 补饲 Arg 和 Gln

Arg是一种条件性必需氨基酸，作为一氧化氮(NO)的前提物质，不仅在营养代谢中起重要作用，参与蛋白质的合成以及尿素、肌酸、多胺和激素的合成与释放，还对肠黏膜免疫屏障功能起着至关重要的调节保护作用。Arg可促进肠道T细胞活化，增加吞噬细胞活性，强化肠道免疫屏障对外来病原体、内毒素的清除作用。研究表明，饲粮添加Arg对多种病理因素尤其脂多糖(LPS)、热应激等所致的肠黏膜损伤有明显的缓解作用，改善肠黏膜结构及免疫屏障功能［14］。Zhu等［15］研究发现，L－Arg对疟疾感染的小鼠有潜在治疗功能，可以提高宿主免疫应答，饲粮补充L－Arg，可显著增加感染早期小鼠的胃肠和脾脏CD4+T细胞、IFN－γT细胞以及巨噬细胞数量，同时伴随着CD4+、IFN－γT细胞、巨噬细胞数量明显增加，TNF－α和NO水平提升，此外，成熟DC的兼容性复合基因Ⅱ(MHC－Ⅱ)、CD86和 TLR－9基因表达上调。Fan等［16］在对严重烧伤的小鼠试验中发现，肠内营养补充Arg改变肠道细胞因子浓度，sIgA数量较对照组显著升高，同时，IL－4和 IL－10水平增加，而IFN－γ和IL－2水平显著降低。

Gln是一种条件性必需氨基酸，是肠黏膜细胞蛋白、核酸合成的底物。Gln是肠道上皮细胞和淋巴细胞的最主要能源物质，同时又是细胞增殖分化的氮源，可满足上皮细胞快速增殖、修复的需要，充分保证肠道正常发育，尤其是降低应激状态所导致的肠黏膜通透性变化，稳定肠黏膜上皮细胞的紧密连接结构［17］，抑制细菌和毒素的移位侵入途径，并大幅度增强肠黏膜免疫性能，提高淋巴细胞、吞噬细胞功能。因此，在饲粮中可以考虑添加适量的Gln以维持上皮细胞增殖与修复的需要，进而保护肠道屏障功能，缓解多种因素所致的黏膜损伤状况。研究表明，动物机体受创、烧伤后，补充Gln能明显抑制TNF－α表达、增加肠黏膜sIgA的分泌和肠黏膜上皮内T细胞、B细胞增殖活力，减轻多种严重创伤导致的肠黏膜机械屏障和免 疫屏障的损伤［18］。Han 等［19］发现 Gln 对TNF－α、IL－2 和 IL－10 的产生和释放以及炎性、抗炎性细胞因子之间的平衡有重要影响。在肠内、肠外营养添加Gln饲喂小鼠的试验1周后发现，肠内营养Gln组较对照组TNF－α含量显著下降;相同时间点内，肠外营养Gln组与对照组的TNF－α含量相比亦有显著下降的趋势;肠内营养Gln和对照组的IL－2水平较饲喂第4天显著上升，而IL－10水平显著下降。

2.2.2 饲粮 Zn、Se 水平

Zn、Se不仅是维持动物肠道健康的重要营养性微量元素，还可通过结合抗体和细胞因子来调节黏膜免疫应答。研究表明，饲粮中适宜的Zn水平可促进肠黏膜sIgA和IL－2的分泌，进而维持肠黏膜免疫屏障功能，同时针对动物机体抗氧化能力、生产性能以及肠炎症类疾病的防治具有较好的饲喂效果［20－21］。Zhang 等［22］在饲粮中添加 Zn对沙门氏菌攻毒肉仔鸡肠黏膜屏障功能影响的试验中发现，在鼠伤寒沙门氏菌感染的情况下，不同饲粮Zn水平有利于缓解伤寒沙门氏菌应激对于回肠黏膜SOD活性和sIgA含量的降低情况，增加紧密连接蛋白1(ZO－1)的含量，维持肠黏膜屏障功能。

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)是动物机体抗氧化和局部、整体免疫的关建酶［23］，而Se作为GPx的重要组成成分，可维持肠黏膜屏障相对稳定。Smith等［24］在Se对小鼠胃肠特定线虫驱除以及免疫应答变化的研究中发现，饲粮缺Se会抑制小鼠小肠内局部TH2基因表达，进而抑制肠黏膜屏障的自我免疫保护;而饲喂充足Se饲粮的小鼠小肠内寄生虫诱导的局部免疫应答加强，分泌 IL－4、IL－5、IL－6、IL－10 和 IL－13 等细胞因子，可快速恢复黏膜免疫功能以及自我驱虫机制。值得注意的是，过量尤其是中毒剂量的Zn、Se水平严重影响胃肠黏膜结构完整性和上皮淋巴细胞数量、结构。因此，应控制饲粮适宜的微量元素水平，同时注意微量元素之间的协同、拮抗作用。

2.2.3 饲粮维生素A水平

维生素A动物机体内的代谢产物视黄酸影响肠黏膜DC数量、sIgA含量、T细胞和B细胞功能以及细胞因子的产生，同时VA也可减弱黏膜炎症和恢复维生素A缺乏所导致的黏膜免疫应答受损状况。DC是肠黏膜中功能最强的APC，其表面的TLR受体识别外源病原体刺激后，迅速诱导DC的成熟化并向次级淋巴组织迁移，进而与T细胞共同影响细胞因子和炎症因子的合成，产生一系列免疫应答。研究表明，维生素A显著调节肠黏膜DC的数量、变异性、成熟程度，进而影响识别受体模式 TLR2、TLR4和 MyD88基因表达［25］。另外，Dong等［26］发现，DC也是维生素 A的关键靶细胞，且维生素A酸受体(retinoic acid receptor，RAR)在维生素A黏膜免疫中对维生素A活性起重要作用。因此，从APC(如DC、巨噬细胞)这一免疫应答起始环节来研究维生素A作用黏膜免疫以抵抗黏膜感染症状的免疫研究被广泛认可。

2.3 预防应激

环境因素的突然变化(温度变化、饲粮变化、抗生素的使用等)、惊吓、束缚以及不可预见性的长时间慢性轻度应激等多种应激方式会对动物机体多系统多组织器官产生影响。肠道是最易受应激反应影响的器官之一，尤其肠黏膜结构的完整性受之影响更甚，诸多应激方式还会诱导肠黏膜免疫系统的免疫激活。其中热应激严重损伤动物机体的黏膜结构和黏膜免疫屏障性能，是动物生产性能和肠道健康的重要环境制约因素［27］。研究证实，热应激、氧化应激等抑制黏膜免疫功能的主要原因是其导致内毒素含量显著增加，进而诱导机体炎症反应。内毒素是革兰阴性细菌细胞壁外膜上的一种LPS与微量蛋白质的复合物。LPS对肠黏膜产生强烈的免疫刺激，使肠黏膜通透性增高、局部吞噬细胞和炎性介质数量增加，尤其破坏黏膜免疫的M细胞启动步骤，直接或间接损伤小肠黏膜屏障功能。Liu等［28］在内毒素改变小鼠胃肠黏膜免疫屏障功能的研究中对试验组小鼠进行尾静脉注射LPS(100 mg/头)以刺激小鼠胃肠道，注射后2、6、12和24 h分4个时间点观察肠道免疫指标变化，发现试验组在相同时间点内与对照组相比，小肠黏膜M细胞、DC细胞、CD8+T细胞、SIgA数量显著减少;相反，Tr细胞、CD4+T细胞以及凋亡淋巴细胞数量显著增加;同时，小肠黏膜IL－4、IFN－γ水平在不同时间段内呈现增加或减少的变化趋势。因此，多角度阐明LPS引起的免疫应激对肠黏膜免疫功能影响的作用机制，探究不同应激方式所附带的不同特异性免疫效应的潜在规律，将是今后研究应激的致病、防治工作的主要关键点。在束缚性应激、氧化应激、热应激等应激状态下，动物机体会产生一系列活性氧族(reactive oxygen species，ROS)，包括超氧阴离子(·O－2)、过氧化氢(H2O2)、羟自由基(OH·)等，这些活化氧过量表达时，肠黏膜组织受损，大分子发生过氧化［29］，如DNA损伤、淋巴细胞功能丧失甚至凋亡、肠黏膜免疫屏障功能下降。另外，失血性休克、创伤、烧伤和肠内营养缺失［30－32］等重度应激状况可导致动物机体全身性的免疫失调，严重影响胃肠黏膜免疫屏障的防御功能，如动物在失血性休克时，各器官的血液供给发生变化，肠道会处于缺血缺氧的低灌注状态并且不易恢复，T细胞的分化能力降低，炎性细胞因子释放量增加。

应对上述应激的预防措施主要有:1)减少氧化应激，如应用别嘌呤;2)饲粮中添加牛初乳和山羊奶粉;3)补饲Gln直接对上皮免疫细胞补充营养;4)使用低浓度一氧化碳(CO)以抑制LPS所致损伤;5)提前热应激处理。

2.5 其 他

近年来，肠黏膜免疫保护的研究更加趋向于多组织器官、多层次营养和多应用水平相结合的研究方向发展，除上述所介绍的预防保护措施外，神经干预、核苷酸、脂肪酸、N－乙酰半胱氨酸、酵母复合物以及异麦芽低聚糖、低聚果糖等功能性低聚糖也是常见且应用效果明显的影响黏膜免疫屏障的重要因素。例如，肠神经系统(ENS)和GALT的免疫细胞分泌的降钙素基因相关肽(calcitonin gene－related peptide，CGRP)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)和神经肽(neuropeptide Y，NY)等相关神经介质在很大程度上影响淋巴细胞增生、细胞因子和IgA的合成释放进而诱导肠黏膜免疫应答，可通过运用神经活性药物或神经阻断等方式来调节肠黏膜免疫性能。

3 小 结

肠黏膜免疫屏障功能主要是依靠以sIgA为代表的分泌型免疫球蛋白和以IEL、LPL等为代表的免疫活性细胞以及诸多细胞因子共同的免疫调控来实现。针对性的采取有效措施以期改善肠黏膜免疫防御效果，加强肠黏膜免疫屏障性能必然是未来免疫学、营养学、动物生理学等领域的研究重点。目前，还有许多影响肠黏膜免疫屏障功能的制约因素被人们忽略或未被明确解析。例如，霉菌毒素对肠黏膜T细胞数量、巨噬细胞功能的抑制程度尚未明确;TLR2和TLR4等主要病原体识别受体识别外来危险信号与下游炎性介质、细胞因子激活合成的详细链接过程还不完全清楚;生长抑素、重组人生长激素、胰高血糖素样肽－2等肠道营养效应生长类激素在肠黏膜机械屏障和免疫屏障之间的综合应用效果以及部分免疫淋巴细胞和分子在神经－免疫－内分泌网络体系、肠黏膜免疫、炎症反应和过敏反应等生理病理过程之间的调节关联方式亦有待进一步重视和研究。针对这些问题，通过进一步的深入研究，以期更全面的为肠黏膜免疫的研究和肠道类免疫性疾病的防治提供科学依据。

致谢:感谢国家自然科学基金(31101739)和现代农业(奶牛)产业技术体系建设专项资金(CARS－37)的资助，同时感谢马燕芬、杜瑞平、张兴夫老师在文稿写作中给予的宝贵意见。

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