快速DNA提取环介导等温扩增技术检测结核分枝杆菌的成本分析

欧喜超 夏辉 李强 逄宇 赵冰 张治英 李俊晨 章建康 池俊英 赵雁林

结核病的早期诊断，对于很好地控制结核病的传播具有十分重要的意义。固体培养具有很高的诊断价值，但耗时较长，至少需要6～8周的时间。近年来涌现出很多新的技术和方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定[1-2]。然而除了检测效能，检测成本也是制约各种技术或方法能否推广的决定性因素之一。结核分枝杆菌快速DNA提取环介导等温扩增检测技术(procedure for ultra rapid extraction of loop-mediated isothermal amplification, PURE-LAMP；Eiken Chemical，日本)是一种基于分子生物学原理的快速检测试剂盒，整个试剂盒采用封闭的反应体系，在反应体系内加入2条内引物和2条外引物，67 ℃等温扩增40 min，然后通过紫外线照射观察荧光强度进行结果判断[3]。国内外的相关研究表明，PURE-LAMP检测操作简单、检测准确性高，非常适合在实验室条件不足或技术力量薄弱的结核病高负担地区应用[4]。目前尚缺乏关于PURE-LAMP检测成本的相关报道，本研究通过对比传统固体培养法和PURE-LAMP检测的成本，从成本角度出发，评估PURE-LAMP检测在我国县(区)级实验室应用的可行性。

材料和方法

一、研究资料的来源

选取项目指定的河南省新乡市结核病防治(简称“结防”)所、获嘉县CDC以及河南省CDC作为研究现场。2011年3月至2012年2月，新乡市结防所和获嘉县CDC共连续纳入1378例临床初诊肺结核可疑患者，新乡市923例，获嘉县455例。实验室对每份纳入患者痰标本同时进行固体培养和PURE-LAMP检测，培养阳性的菌株4 ℃冰箱保存，每月送至河南省CDC完成对硝基苯甲酸(PNB)菌群鉴定。为保证鉴定结果的准确性，每批固体培养阳性菌株在鉴定前需要进行传代复苏。

二、研究方法

每例纳入患者留取3份痰标本(即时痰、夜间痰和晨痰)，实验室工作人员对晨痰和夜间痰进行固体培养试验和PURE-LAMP检测，培养阳性菌株送至河南省CDC，对每例患者选取生长状态最好的1管阳性菌株进行传代培养和菌群鉴定试验。

1. 结核分枝杆菌的传统固体培养：遵照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》[5]中的标准化操作程序，将每份处理后痰标本接种到2支商品化固体改良罗氏培养管中，培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。

2. 菌群鉴定：采取PNB法进行菌群鉴定，具体操作参照《结核病诊断实验室检验规程》[6]中的标准化操作程序执行。接种后3 d 观察结果，以后每周观察1次，直至孵育4周，同时记录PNB培养基和中性改良罗氏培养基上菌落生长情况。在PNB培养基上未见菌落生长即为结核分枝杆菌复合群感染，生长则为非结核分枝杆菌感染。

3. PURE-LAMP检测：使用PURE-LAMP法荧光检测试剂盒，按照日本荣研化学公司提供的标准化操作手册进行操作[7]。

4.“要素法”成本分析：收集检测整个过程(从实验室接收标本到报告结果和废弃物处理等)所有直接和间接成本[8]，涉及以下几方面要素：(1)管理费：维持实验室正常运转的基本费用，如水、电、办公费、清洁、废弃物和垃圾处理、安保等；(2)建筑费：实验室建筑、改造及维修费用；(3)设备费：仪器设备的购买、维修、维护费用；(4)人员费：从事检测相关人员工资、福利、津贴费用；(5)试剂费：检测相关试剂费用；(6)耗材费：耗材及个人防护相关费用。

为了有效核算相关成本，需要针对实验室检测的所有步骤和程序分别收集相关数据，进行评估。固体培养试验包括试剂准备、标本收集登记、培养操作、培养结果观察登记和废弃物处理等步骤。PNB菌群鉴定试验包括试验试剂耗材准备、鉴定试验操作、结果观察登记、废弃物处理等步骤；PURE-LAMP试验包括试剂准备、前处理及核酸扩增检测几个过程。

实验人员按照要求在3个不同工作日，分别记录3次高、中和低不同工作量情况下传统固体培养、PURE-LAMP检测和PNB菌群鉴定试验全过程中的资源使用情况，各要素的成本以试验过程中使用的各要素的数量乘以各要素的单位价格。其中资本性费用如实验室空间、建筑物和设备等，其单位价格根据其采购价格和预计的使用年限按照年度折算；管理费用的计算是根据实验室工作人员数量、人员工作时间和其他与该系统相关的基础设施、建筑物的使用状况，将相关费用分配到各次检测中。PURE-LAMP检测试剂的价格采用项目采购价格106元计算，固体培养和菌群鉴定相关耗材的价格采用目前市场采购价格。

结 果

一、每份痰标本固体培养和PURE-LAMP检测成本分析

固体培养和PURE-LAMP检测的单位检测平均成本分别为51.10和120.90元，均以试剂费和耗材费所占比例较高，新乡市固体培养检测成本略高于获嘉县，主要是由于新乡市的管理成本、人员费和耗材费用较高，新乡市和获嘉县PURE-LAMP检测平均建筑费分别为0.0042和0.0027元(表1)。

二、每例菌株传代和菌群鉴定试验成本分析

菌株传代和PNB菌群鉴定的单位检测成本分别为21.37和56.68元(表2)。

三、每例患者传统方法检测和PURE-LAMP检测成本分析

传统方法检测每例患者是否感染结核分枝杆菌(2份培养，1份传代，1份PNB鉴定试验)需要180.25元，PURE-LAMP检测每例患者是否感染结核分枝杆菌需要120.90元，比传统方法低59.35元。

四、不同检测准确度及患病流行率不同时， PURE-LAMP检出每例结核病患者的成本

计算在不同结核病患病流行率的可疑人群中，与固体培养试验相比，不同敏感度和特异度的PURE-LAMP检出1例结核病患者的平均成本，平均成本=PURE-LAMP检测成本/[(1-流行率)×(1-特异度)+流行率×敏感度)]。可疑人群中结核病流行率越高，应用固体培养和PURE-LAMP检测检出1例结核病患者的单位成本越低。当PURE-LAMP检测特异度为95%时，只要敏感度高于60%，在结核病患病率低于50%的人群中，PURE-LAMP检出1例结核病患者的平均成本均低于传统方法(固体培养和PNB菌群鉴定试验)(图1)。

五、PURE-LAMP检测设备和试剂耗材价格变化时对单位检测成本的影响

由于PURE-LAMP检测设备和试剂价格在整个成本中占有较大比重，并且对于将来市场推广具有一定影响，因此在项目使用的设备及试剂价格基础上，调整了50%、80%、100%、120%、150%和200%，分析价格变化对检测成本的影响。结果显示，当LAMP检测设备价格分别调整为现有价格的50%时，单位检测成本仅下降了0.17元，而当设备价格为现价格的200%时，单位检测成本较现有价格仅上升了0.38元，设备价格的变化对单位检测的成本影响不大；但是，当调整检测试剂为现价格的200%时，单位检测成本将增加108.86元，达到229.76元，单位检测成本随试剂价格的变化幅度比较大。

讨 论

本研究采用“要素法”成本分析比较了在我国县(区)级结核病实验室固体培养和PURE-LAMP检测分别用于结核病诊断的成本。整个研究从卫生服务的角度出发，分析与固体培养和PURE-LAMP检测相关的直接和间接的货币成本。研究发现固体培养管理费、建筑费和耗材费均显著高于PURE-LAMP检测，但是PURE-LAMP检测设备和试剂价格较高，导致PURE-LAMP检测单位成本费用高于固体培养。目前，我国县(区)级实验室不具备开展菌群鉴定和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)的能力，固体培养阳性菌株需要送到省参比实验室完成菌群鉴定，导致检测时间和检测成本均显著增加。之前有研究表明，取患者1份痰标本进行PURE-LAMP检测即可达到很好的检测效能[7]。因此，本研究中每例患者PURE-LAMP检测成本按照1份痰标本检测进行计算。综合考虑每例结核病患者的实际诊断情况，PURE-LAMP检测成本低于固体培养。

一、固体培养和PURE-LAMP检测成本影响因素分析

通过此次研究，笔者发现诸多因素可能会影响到固体培养和PURE-LAMP检测的成本。首先，PURE-LAMP检测的诊断周期为2 h，而固体培养需要4～8周，这将导致固体培养与时间相关的成本包括管理费、人员费、仪器费等成本显著上升；其次，两个实验室不同检测成本也呈现出地域差异，其中新乡市工作人员工资水平更高，这使得新乡市的人员成本显著高于获嘉县。此外，两个项目点管理费用差别也较大，实验所用耗材为当地自行采购，因此，在耗材方面两个实验室之间也表现出一定的差异。

表1 不同地区每份痰标本固体培养和PURE-LAMP检测的单位检测成本(人民币：元)

表2 河南省CDC进行传代和PNB菌群鉴定的单位检测成本(人民币：元)

Se：敏感度；Sp：特异度

二、固体培养和PURE-LAMP检测成本效益比较

除了更低的价格，PURE-LAMP检测比传统固体培养还有诸多优势。首先，PURE-LAMP检测用时更短。其次，PURE-LAMP检测采用封闭的反应体系，扩增产物无需开盖通过肉眼观察就可判读结果，降低了污染发生的可能性。其三，PURE-LAMP检测更符合生物安全要求；PURE-LAMP检测是一种基于核酸检测的方法，因此其安全性优于传统的涂片镜检和固体培养。综合考虑其成本和这些相关因素，PURE-LAMP检测是一种更符合成本-效益的结核分枝杆菌检测方法。

三、研究局限性

本研究中存在几个明显的不足。首先，本研究虽然分析了两种检测方法的成本，但由于后期效益(包括患者发现后治疗及传播风险等因素)没有加以考虑，因此本研究进行的成本-效益分析不够全面；其次，在分析单个结核病患者的发现费用时，仅从成本角度考虑，但在实际临床检测中，当敏感度低于50%的检测方法无实际使用价值。因此，后续深入研究将围绕如何建立模型评估快速诊断的社会经济效益等方面展开。

总之，本研究表明在目前现有情况下，PURE-LAMP检测是一种比传统固体培养试验更经济更快速的结核分枝杆菌检测方法。如果生产厂商在未来能够降低市场价格并优化产品性能，将更有利于PURE-LAMP检测在县(区)级结核病诊断实验室的推广。

志谢河南省CDC、新乡市结防所和获嘉县CDC工作人员在数据收集过程中给予了支持和配合。美国帕斯适宜卫生科技组织在数据分析和撰写过程中给予了帮助。Hojoon Sohn在方案设计中给予了大力帮助

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