N-乙酰基转移酶2及谷胱甘肽S转移酶M1基因多态性与抗结核药物性肝损伤的关系研究

安慧茹 吴雪琼 王仲元

结核病是一种全球性的公共健康问题，异烟肼(H)、利福平(R)、吡嗪酰胺(Z)是治疗结核病的主要药物。然而，它们均具有肝毒性，且三者联用可以导致肝损伤的可能性增加[1]。而药物性肝损伤的发生常常使患者被迫中断甚至终止治疗，导致治疗效果差、结核病复发和产生耐药，给结核病的控制带来不利影响。了解这些药物引发肝损伤的危险因素和机制，对降低抗结核药物性肝损伤的发生率和控制结核病疫情都非常必要。药物性肝损伤应与该药在肝中代谢毒物产生及排除有关，因此，药物代谢酶的多态性应与抗结核药物的肝损伤密切相关。

N-乙酰基转移酶2(N-acetyltransferase 2，NAT2)在肝脏中参与包括H、R在内的一线抗结核药物的代谢。NAT2的编码基因位于第8对常染色体的短臂2区2带，该基因多态性与NAT2酶活性密切相关。H通过NAT2的乙酰化作用生成乙酰异烟肼,后者水解为异烟酸和乙酰肼，乙酰肼一部分进一步水解为肼，一部分在NAT2酶的作用下生成无毒物质排出体外。肼及乙酰肼已被认定是肝毒性物质，可以导致药物性肝损伤的发生[2-3]。因此，NAT2活性可能影响乙酰肼乙酰化成无毒物质的比例。R具有诱导肝脏多种代谢酶的作用[4],其不仅在肝中去乙酰化为异烟肼乙酰化提供乙酰基，且可诱导肝药酶活性，加速乙酰异烟肼代谢为乙酰肼，从而增加异烟肼的肝毒性。这些过程均与NAT2酶活性相关。

谷胱甘肽S-转移酶(GST)是1种多功能的参与体内生物转化的Ⅱ相解毒代谢酶,在很多外源性化合物和药物的解毒代谢中起重要作用。编码GST的人类GST基因是1个超基因家族,已分离出Alpha(A，GSTA)、Mu(M，GSTM)、Theta(T，GSTT)和pi(P，GSTP)4个亚家族。人类GST基因决定谷胱甘肽S-转移酶活性，能催化还原型的谷胱苷肽(GSH)的巯基(-SH)结合到疏水的化合物上,使亲电子的化合物变成亲水的物质,易于从胆汁或尿液中排泄,通过这种方式将体内各种致癌物和断裂剂产生的亲电子试剂、有潜在毒性的物质及亲脂性化合物降解排出,因此GST在机体代谢有毒化合物、保护细胞免受急性毒性化学物质攻击和抑制细胞癌变中起着重要的作用[5]。Strange等[6]研究报道GSTM1、GSTT1基因缺失可导致酶活性丧失。Watanabe等[7]研究发现GSTM1、GSTT1联合缺失可导致曲格列酮的肝毒性明显增加。以上研究表明，NAT2、GSTM1的基因多态性的研究，对于阐明抗结核药物性肝损伤的分子机制具有一定的意义。

本研究拟通过聚合酶链反应-直接测序(PCR-DS)及多重PCR的方法研究中国人群NAT2、GSTM1、GSTT1基因多态性与抗结核药物诱导肝损伤关系的相关性，以进一步阐明抗结核药物肝损伤的分子机制。

材料和方法

一、患者来源

1.患者的选择标准：所有进入本研究的患者应满足以下条件：(1)均接受一线抗结核药物H、R、Z、乙胺丁醇(E)的治疗，方案如下： 2HRZE/4HR，药物剂量按照体质量(kg)计算，如有药物性肝损伤的发生，方案根据情况随时调整，同时该例患者归为肝损伤组。(2)无营养不良、HIV感染、嗜酒、乙型或丙型等病毒性肝炎、肝病、严重结核病、心功能不全、合并其他药物的使用等可以导致肝功能损害的因素的存在。(3)治疗前肝功能正常，治疗过程中即治疗6个月内能密切监测肝功能的变化。(4)肝功能损害符合药物性肝损伤诊断标准[8]，即血清丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)高于正常水平的2倍以上，和(或)碱性磷酸酶(ALP)高于正常1.5倍以上；和(或)胆红素升高伴有恶心、呕吐等消化道症状者。符合药物性肝损伤的诊断标准，同时除外使用其他药物和疾病引起肝功能异常的情况，因此，只要以上条件满足即可诊断为抗结核药物性肝损伤。

2.患者分组：经解放军第三〇九医院伦理委员会审核通过，研究对象知情，并签署知情同意书，采用病例-对照研究方法，选择2008—2009年度满足上述条件的我院初治住院结核病患者208例，选取本科明确抗结核药物性肝损伤发生的所有患者为肝损伤组(共101例)，选取无抗结核药物性肝损伤发生的患者为对照组(共107例)，所有患者治疗的前2个月每周检测患者ALT、AST、直接胆红素(DBIL)、总胆红素(TBIL),之后每月检测1次，当有恶心、呕吐、厌食等消化道症状时随时检测患者肝功能指标。ALT,AST检测采用IFCC(International Federation of Clinical Chemistry)速率法，单位IU/L,DBIL，TBIL检测采用钒酸氧化法,单位μmol/L。

肝损伤组，男56例，女45例；对照组，男75例，女32例。肝损伤组，年龄15～64岁，平均年龄(36.00±15.72)岁；对照组，年龄18～61岁，平均年龄(33.36±16.71)岁，两者比较差异无统计学意义(t=1.172，P>0.05)。用药前肝损伤组患者血清ALT(21.47±14.29)IU/L、AST(21.56±10.93)IU/L、DBIL(4.31±1.99)μmol/L、TBIL(11.65±4.71)μmol/L；对照组ALT(23.95±12.91)IU/L、AST(19.72±9.81)IU/L、DBIL(3.87±2.33)μmol/L、TBIL(11.84±4.83)μmol/L，两组比较t值分别为1.314、1.278、1.475、0.281，P值均>0.05，差异无统计学意义。用药后,肝损伤组ALT(292.85±141.43)IU/L、AST(219.82±162.13)IU/L、DBIL(16.95±29.41)μmol/L、TBIL(26.82±26.19)μmol/L；对照组ALT(32.26±18.17)IU/L、AST(24.09±15.39)IU/L、DBIL(4.48±2.55)μmol/L、TBIL(11.88±4.96)μmol/L，两组比较t值分别为4.835、7.492、4.250、5.637，P值均<0.001，差异有统计学意义。

二、操作方法和步骤

1.基因组DNA的提取：采集上述两组患者晨起空腹静脉血2 ml于含有柠檬酸抗凝剂的试管中，置于-40 ℃储存备用。常温溶解冻存血液，使用全血基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司，DP304试剂盒)，按照说明书提取1 ml静脉血中的基因组DNA，溶解于0.1×TE缓冲液，置于-20 ℃储存备用。

2.NAT2基因检测：(1) 引物的设计与合成：从www.ncbi.nlm.nih.gov数据库中获得NAT2基因序列，利用Oligo 6.0软件设计上游引物5′-TGAA AGAATTGGCTATAAGA-3′；下游引物5′-CAA AATAACGTGAGGGTAGAG-3′，上海生工生物技术有限公司合成，该对引物可扩增NAT2基因编码区及其下游基因共951 bp片段。(2) PCR扩增：在50 μl 反应体系中,4 种dNTP的终浓度为0.2 mmol/L,引物的终浓度各为0.3 mmol/L，DNA 模板10～100 ng,Taq DNA聚合酶1 U。扩增参数为94 ℃变性1 min, 52 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环后72 ℃延伸7 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

3.NAT2基因测序与基因型分析：上述扩增产物50 μl送上海生工生物技术有限公司测序。利用http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi进行测序结果的序列比对，并根据http://nat.mbg.duth.gr/Human%20NAT2%20alleles_2013.htm提供的信息及参照Huang等[2]、Cho等[9]进行测序结果的NAT2基因型分析。

4.GSTM1、GSTT1基因检测及基因型分析：(1)GSTM1、GSTT1引物来源：参照文献[10]的报道,GSTM1上游引物：5′-GAACTCCCTGAAAA GCTAAAGC-3′，GSTM1下游引物：5′-CTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3′，该对引物扩增产生219 bp片段。GSTT1上游引物：5′-TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC-3′，GSTT1下游引物：5′-TCACCGGATCATGGCCAGCA-3′，扩增产物459 bp。β-球蛋白上游引物：5′-CAACTTCATCCACGTTCACC-3′，β-球蛋白下游引物：5′-GAAGA GCCAAGGACAGGTAC-3′，扩增产物268 bp。(2)PCR扩增：在50 μl 反应体系中,4 种dNTP的终浓度为0.2 mmol/L,引物的终浓度各为0. 3 mmol/L，DNA 模板10～100 ng,Taq DNA聚合酶1 U。扩增参数为94 ℃变性40 s, 52 ℃退火1 s,72 ℃延伸1 min,35个循环后72 ℃延伸7 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。(3)GSTM1、GSTT1基因扩增产物分析：用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。以β-球蛋白上下游引物扩增阳性为参照，若产生219 bp片断说明GSTM1为非缺失基因型，否则为缺失基因型；若产生459 bp片断说明GSTT1为非缺失基因型，否则为GSTT1缺失基因型。

三、统计学分析

结 果

一、NAT2基因多态性

本研究共发现8个基因多态性位点，包括基因编码区190 C→T，282 C→T，341 T→C，481 C→T，499 G→A，590 G→A，803 A→G，857 G→A，除282多态性位点不导致氨基酸改变外，其余均引起氨基酸替换。各个位点碱基分布均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，表明样本来自遗传平衡群体，有较好的代表性。

二、NAT2乙酰化基因型与抗结核药物性肝损伤的关系

依据药代动力学乙酰化速率的不同可将人群NAT2基因分为快乙酰化基因型、中乙酰化基因型和慢乙酰化基因型。本研究根据http://nat.mbg.duth.gr/Human%20NAT2%20alleles_2013.htm提供的信息(部分信息见表1)对NAT2基因测序结果进行基因型分析，发现肝损伤组101例患者中，61例(60.4%)为NAT2快、中乙酰化基因型，40例(39.6%)为NAT2慢乙酰化基因型；对照组107例患者中，94例(87.9%)为NAT2快、中乙酰化基因型，13例(12.1%)为NAT2慢乙酰化基因型，两者比较，基因型分布差异具有统计学意义(χ2=20.62，P<0.05)。尤其NAT2*5B/7B、NAT2*6A/7B、NAT2*6A/6A慢乙酰化基因型在两组中分布差异具有统计学意义(χ2值分别为4.32、14.90、6.40，P值均<0.05)。NAT2*5B/7B基因型患者4例均发生了抗结核药物肝损伤。NAT2*6A/7B、NAT2*6A/6A基因型患者发生抗结核药物肝损伤OR值分别达到8.40(95%CI=2.85～24.73)、4.67(95%CI=1.42～15.44)(表2)。

表1 NAT2基因型与碱基改变及氨基酸变化之间的对应关系

表2 各乙酰化基因型分布和发生抗结核药物性肝损伤的关系

三、GSTM1、GSTT1基因多态性

GSTM1缺失基因型占57.7%(120/208)，GSTT1缺失基因型占46.6%(97/208)。部分PCR产物2%琼脂糖电泳图谱见图1。

M：DNA相对分子质量标准(1100,1000,900,800,700,600,500, 400,300,200,100 bp)；阴：阴性对照，样本编号1～23为部分患者DNA的扩增产物

四、GSTM1及GSTT1基因型与抗结核药物性肝损伤关系

肝损伤组GSTM1缺失基因型占63.4%(64/101)，GSTM1非缺失基因型占36.6%(37/101)；对照组GSTM1缺失基因型占51.4%(55/107)，GSTM1非缺失基因型占48.6%(52/107)，利用χ2检验处理，两组比较GSTM1缺失基因型发生药物性肝损伤OR值偏高，为1.64(95%CI=0.94～2.84，P>0.05)。肝损伤组GSTT1缺失基因型占47.5%(48/101)，GSTT1非缺失基因型占52.5%(53/101)，对照组GSTT1缺失基因型占45.8%(49/107)，GSTT1非缺失基因型占54.2%(58/107), 利用χ2检验处理，两组比较OR值接近(P>0.05)(表3)。

五、NAT2基因型与GSTM1基因型联合作用与抗结核药物性肝损伤关系

同时具有NAT2慢乙酰化基因型及GSTM1缺失基因型的患者发生抗结核药物性肝损伤的OR值高达10.21(95%CI=3.87～26.96，P<0.05),高于只具有NAT2慢乙酰化基因型(OR=4.74；95%CI=2.42～9.28,P<0.01)或GSTM1缺失基因型(OR=1.64；95%CI=0.94～2.84,P>0.05)的患者(表4)。

讨 论

药物代谢酶在药物代谢过程中起着非常关键的作用，这些酶的基因多态性影响着酶的活性，与药物性肝损伤密切相关[3，11]。

早期有报道，认为NAT2快乙酰化型患者更容易发生抗结核药物性肝损伤[12]。之后，较多报道认为慢乙酰化基因型患者易于发生抗结核药物性肝损伤[12-13]，但近来也有学者认为NAT2乙酰化基因型与抗结核药物性肝损伤的发生无关[14]。鉴于上述报道的不同，有必要进一步研究国人NAT2乙酰化基因型及其基因多态性与抗结核药物性肝损伤之间的关系。

本研究发现，NAT2慢乙酰化基因型与抗结核药物性肝损伤密切相关，其中NAT2*6A/7B、NAT2*6A/6A基因型者在两组中分布差异有统计学意义，发生抗结核药物性肝损伤的OR值分别为8.40、4.67,这与国外许多学者的报道一致[2,13-14]。Huang等[2]通过对224例接受抗结核药物治疗的结核病患者的研究发现，与快乙酰化基因型患者相比，慢乙酰化基因型患者中的NAT2*6/6、NAT2*6/7基因型发生药物性肝损伤的OR值为4.02，差异有统计学意义。Possuelo等[13]也报道NAT2*6/6，基因型者在使用抗结核药物后，肝损伤组和无肝损伤组的分布差异具有统计学意义，其发生抗结核药物性肝损伤的OR值为5.7。Higuchi等[14]也发现NAT2*6A/7B基因型者易于发生抗结核药物性肝损伤。Wang等[15]对14篇中外文献数据进行总结，对照分析了474例抗结核药物性肝损伤患者及1446例未发生药物性肝损伤的患者，发现与NAT2快乙酰化基因型比较，NAT2慢乙酰化基因型发生抗结核药物性肝损伤的OR值为4.697，差异有统计学意义；通过亚群分析发现，在亚洲人群和非亚洲人群中，NAT2慢乙酰化基因型更易于发生抗结核药物性肝损伤。这也更加证实了NAT2慢乙酰化基因型与抗结核药物性肝损伤密切相关。

表3 GSTM1及GSTT1基因型与抗结核药物性肝损伤关系

表4 结核病患者NAT2及GSTM1基因型联合作用与抗结核药物性肝损伤的关系

Huang等[10]对中国台北人群有、无抗结核药物性肝损伤的各115例患者进行对照研究发现：GSTM1缺失基因型发生抗结核药物性肝损伤的OR值为2.23(P=0.033)，与抗结核药物性肝损伤密切相关。Leiro等[16]对西班牙35例抗结核药物性肝损伤及60例无肝损伤患者的GSTM1及GSTT1基因型的多态性进行研究发现：GSTT1缺失基因型发生抗结核药物性肝损伤的OR值为2.60(P=0.03),GSTM1缺失基因型发生抗结核药物性肝损伤的OR值为0.73(P=0.48)。本研究发现GSTT1、GSTM1缺失基因型与抗结核药物性肝损伤无关，这与Monteiro等[17]、Tang等[18]的研究一致。Monteiro等[17]对117例接受抗结核药物治疗的结核病患者的研究发现，药物性肝损伤的发生率为33.3%；GSTT1、GSTM1缺失基因型与抗结核药物性肝损伤无关,但与GSTM1非缺失基因型相比，具有GSTM1缺失基因型的患者服用抗结核药物后发生肝损伤更严重。Tang等[18]对89例发生药物性肝损伤的涂阳肺结核患者和未发生抗结核药物性肝损伤的涂阳肺结核患者的对照研究发现，GSTT1、GSTM1缺失基因型与抗结核药物性肝损伤无关。上述研究关于GSTM1、GSTT1基因多态性与抗结核药物性肝损伤的关系的不一致性，可能与GSTM1、GSTT1基因型分布存在人群及种族的差异或抗结核药物肝损伤与多基因共同作用或基因与环境共同作用有关。本研究虽未发现它们与抗结核药物性肝损伤的直接关系，但发现GSTM1缺失基因型发生抗结核药物性肝损伤的风险偏高，是否存在关联，将进一步扩大样本量加以证实。

本研究首次对NAT2基因多态性与GSTM1基因多态性联合作用与抗结核药物性肝损伤的关系进行研究，发现与单纯具有NAT2慢乙酰化基因型(OR=4.74,P<0.05)、GSTM1缺失基因型(OR=1.64，P>0.05)患者相比，同时具有NAT2慢乙酰化基因型及GSTM1缺失基因型患者发生抗结核药物肝损伤OR值高达10.21(P<0.05)，差异有统计学意义。

总之，NAT2乙酰化基因型与抗结核药物性肝损伤密切相关，而慢乙酰化基因型患者更易发生抗结核药物性肝损伤。同时具有NAT2慢乙酰化基因型与GSTM1缺失基因型的患者发生抗结核药物肝损伤的风险增高。通过对NAT2及GSTM1基因的进一步研究，有望深入了解抗结核药物性肝损伤的发生机制、建立抗结核药物致肝损伤易感基因型的分子生物学检测方法，以指导临床抗结核药物和保肝药物的应用。这对于减少肝损伤的发生、控制结核病疫情具有重要意义。

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