关于原子荧光光度计校准曲线若干问题的讨论

张国城　杨　洋

(北京市计量检测科学研究院，北京 100029)

0　引言

原子荧光光度计具有分析灵敏度高、干扰少、线性范围宽、可多元素同时分析等特点，是一种优良的痕量分析技术，在环保、食品、疾控等领域有广泛应用。该仪器是先建立校准曲线再来实现样品检测的，无论是该仪器的检定还是使用，都对校准曲线的线性提出了严格的要求。但是，经常遇到一些原子荧光光度计经计量检定合格，但是用来检测样品时却误差很大的情况。为此，本文将详细讨论校准曲线的建立和选取中存在的若干问题，为广大计量工作者和仪器使用者提供参考。

1　标准曲线的制作

原子荧光光度计标准曲线的制作一般是通过配置一系列不同浓度的溶液，进样相同体积来进行的(浓度法)。但在比较新型的原子荧光光度计中，不仅实现了自动进样，而且实现了自动稀释功能，即可只提供某一高浓度的母液，然后仪器根据程序设置每次取不同体积自动稀释来制备校准曲线(体积法)。那么这两种不同的制作方法对校准曲线是否有影响呢？

两种方法的区别在于待测样品中待测物质/溶剂的比例不同。由于原子荧光光度计溶液中，除了砷等标准物质外，还需要加入硫脲等还原剂，浓度法中溶剂的环境基本是一致的，其优点是若溶剂中存在干扰物质，则容易与待测物质区别开来。体积法中干扰物质也会随标准系列增加，变化趋势与待测物质可能一致，不容易实现两者的区分。另外，浓度法容易实现较大浓度跨度。

总之，体积法和浓度法本质上是一致的。但实践过程中发现，由于部分人员操作不熟练，用浓度法配置的溶液不甚理想，导致线性相关系数较差；而体积法中机器操作则减小了这种人为因素的影响，所以能得到较好的校准曲线。

2　校准曲线的有效期

很多化学分析仪器在分析之前，需要建立一条校准曲线。校准曲线建立以后，其有效期根据被检测对象的复现性，长的可以几个月，如液相色谱仪等，短的不到一天甚至只有几个小时，典型的就是原子荧光光度计。一方面，是因为砷等物质需要加入硫脲等还原剂，将其从五价还原到三价，以加快其与硼氢化物反应的速度，该还原时间有时比较长。但经验表明，即使是还原充分的砷溶液，若用其他方法表征该溶液可能具有足够的稳定性和重复性，但是若用原子荧光光度法在不同时段表征时，其荧光信号值仍可能发生较大变化，即复现性差。这是因为原子荧光的检测过程涉及复杂的动态化学反应和物质传输过程，影响因素多，难以克服。所以，为了减少各种因素的干扰，一般要求待测样品与标准溶液同一天配制，建立的标准曲线有效期很短。

3　线性相关系数有效数字的保留

根据GB 5750.3—2006《水质分析质量控制》中8.2.7条款有如下规定：校准曲线相关系数只舍不入，保留到小数点后出现非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小数点后都是9时，最多保留小数点后4位。相关系数这一有效数字的处理方法显然不同于平时数据的处理方法，需要引起原子荧光光度计的检定人员和使用人员的注意，它将影响一条已经建立的曲线能否使用。

4　校准曲线的选取

每条校准曲线都有对应的线性相关系数g ，它一般作为评价校准曲线好坏的标准，对于原子荧光光度计的检定，要求g ≥0.995，而一般样品检测时经常要求g ≥0.999。人们往往认为，曲线的线性系数越高，测量误差肯定就越小。诚然，测量误差小则线性系数肯定高，反之线性系数高则测量误差不一定小，需要考虑被测样品浓度范围与校准曲线的关系。

校准曲线建立了两个物理量之间的线性关系，但并不意味着两个物理量在任意范围内都存在相似的关系，这就是常说的仪器线性范围。不同仪器有不同的线性范围，甚至同一仪器在不同状态下的线性范围也有些差别。根据GBT 21191—2007《原子荧光光谱仪》国家标准，要求仪器线性范围达到102～103，但实际操作中并不能建立一条跨度如此大的曲线来满足该范围内样品的检测。就像很多分析仪器需要根据被检测量的范围来选择不同量程一样，原子荧光光度计也应根据不同被测对象的浓度范围建立不同的校准曲线，这是提高测量准确性的需要。

首先，对于大部分分析仪器而言，高浓度和低浓度时，仪器的灵敏度有所差别，一般低浓度时算出的灵敏度比较高。所以，建立的校准曲线与待测样品的灵敏度应该相对应。

(1)

其中Δxi为浓度实测值与标准值之差，即浓度误差。所以可以理解为，线性回归的结果，是使得校准曲线上各点的浓度误差值的平方和最小。由于这里考虑的是绝对误差Δxi，而非相对误差Δxi/xi，所以，对于曲线两端不同浓度区，相同的Δxi引起的Δxi/xi可能差别很大。从相对误差的角度看，线性回归的结果是迁就高浓度，而牺牲低浓度，即使校准曲线线性系数很高，低浓度测量相对误差仍然可能超过100％。

因此，在建立原子荧光校准曲线时，需要注意：

1)建立的校准曲线，最好使得待测样品点落在曲线中部，而不是在曲线两端，更不应在两端延长线上；2)一般来说，校准曲线的最大与最小校准点间最好不超过10倍；3)若一批待测样品的量值确实比较分散，则建议分区间建立多条校准曲线。

5　线性回归引入的不确定度

原子荧光光度计检测结果不确定度评定过程中，往往被忽略却又占很重要比例的就是线性回归引入的不确定度。因为标准曲线的建立是通过统计方法来实现的，存在不确定度，因此，通过曲线得到被测样品的浓度，必然包含了线性回归所引入的不确定度。

根据线性回归不确定度公式(2)，当待测点越偏离校准曲线的中心时，评估得到的不确定度越大(当曲线中各浓度点不是均匀分布时，该中心为所有浓度点的平均值的位置)。

(2)

以某台原子荧光光度计根据JJG 939—2009建立砷校准曲线的数据为例，数据见表1，该校准曲线g =0.999。

表1　某台原子荧光光度计测量砷的曲线数据

选取曲线上若干点(xpred)，利用式(2)(取p=7)计算线性回归引入的扩展不确定度U和相对扩展不确定度Urel(k=2)，结果见表2。

表2数据表明，越靠近校准曲线两端，线性回归引入的扩展不确定度越大；在低浓度端，线性回归引入的相对扩展不确定度非常大，甚至已经超出可接受范围，而高浓度端由于基值大，得到的相对扩展不确定度值看起来却很小。这如同前面所讨论的，从相对误差角度看，线性回归的结果是迁就高浓度，而牺牲低浓度。因此，当被测样品浓度靠近校准曲线低浓度端时，需要重新制作与之相匹配的低浓度的校准曲线，否则得到的测量结果相对误差和线性回归相对扩展不确定度将会很大。相比之下，当样品浓度靠近校准曲线高浓度端时，只要其仍在仪器的线性范围内，测量结果相对误差和线性回归相对扩展不确定度却相对可以接受。

表2　校准曲线上若干点的线性回归扩展不确定度

6　结论

由于原子荧光光谱仪检测过程的复杂性，导致不同时段溶液荧光值复现性差，校准曲线有效期短；需要根据待测样品的浓度建立相匹配的校准曲线，尽量使得测量值落在曲线中部而不是两端，特别是当待测样品量值处于校准曲线低浓度端时，其测量结果的相对误差和线性回归引起的相对不确定度会很大。因此，如果说计量是仪器量值准确的保障，那么建立合理的校准曲线，是实现原子荧光量值准确测量的前提。

[1]艾明泽，肖哲主编.化学计量.北京：中国计量出版社，2007

[2]JJG 939—2009 原子荧光光度计计量检定规程

[3]GB 5750.3—2006《水质分析质量控制》

[4]GB/T 21191—2007 《原子荧光光谱仪》

[5]李慎安，等.化学实验室测量不确定度.北京：化学工业出版社，2007