蛋白质组学在动物科学研究中的应用与分析

马原菲 吕梦园 钊守梅 韩新燕

(浙江大学动物科学学院，农业部华东动物营养与饲料重点实验室，饲料科学研究所，杭州 310029)

人类基因组测序草图的完成，标志着生命科学进入以基因组学、蛋白质组学和代谢组学等为标志的后基因组时代。尽管基因组的研究已经日趋完善，但是其研究只能提供蛋白质的某些一级结构，而蛋白质的高级结构，蛋白质的修饰、活性、定位和蛋白质间相互作用等信息却少之又少。因此，对生命活动执行者——蛋白质的研究成为重要一环，从而蛋白质组学应运而生。它旨在通过蛋白质水平上对细胞或机体基因表达的终产物进行定量和定性的研究，来揭示生命活动规律及基因表达调控机制。随着人们科学研究的深入和蛋白质组学的蓬勃发展，动物科学研究也将迎来新的进展。目前，蛋白质组学技术已经应用于肉品质、蛋品质、乳蛋白等研究中，并得到了海量的信息，为更进一步深入研究奠定了基础，但依然存在诸多问题。本文重点对近年来蛋白质组学在动物科学中的应用现状予以了评析，并发现问题，提出对策和展望，旨在为畜牧科学研究和生产提供借鉴。

1 蛋白质组学及其技术

根据 Swinbanks［1］和 Kahu［2］的报道，1994 年Marc Wilkins首先提出蛋白质组的概念，并最初定义为一个基因所表达的蛋白质。目前，蛋白质组准确化和完整化的定义是一个已知的细胞或组织在某一特定时刻所含有的所有亚基和修饰的蛋白质。因此，我们不难看出，蛋白质组学就是对生物体在蛋白质水平定量、动态、相互作用、整体性的全面研究，来识别及鉴定一个细胞或组织所表达的全部蛋白质及它们的表达模式和表达规律的一门学科。其主要内容包括:1)结构蛋白质组学，即对蛋白质组组成的研究。2)功能蛋白质组学，主要是比较蛋白质组学，它致力于比较、分析发生变化的生理条件下蛋白质组所发生的变化［3］。3)蛋白质组学支撑技术平台和生物信息学研究。

1975年建立的双向凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)技术和 20世纪 80年代末Ferm 等［4］和 Tanaka 等［5］发明的质谱(mass spec-trum，MS)分析方法推动了蛋白质组学的发展。经过近10年的探索在技术上取得了重要进步，其中主要包括蛋白质分离和鉴定2个关键步骤。目前，蛋白质组分离技术主要有2-DE、两维/多维分离、蛋白质芯片技术等。蛋白质组的鉴定技术主要有生物质谱、高效液相色谱、酵母双杂交系统、噬菌体展示技术等。在蛋白质鉴定上主要有2种路线:第1种是传统的2-DE蛋白质分离、胶内酶解与MS鉴定相结合的方法，这也是最常见的一种，与该路线最匹配的是基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)类型的质谱;第2种路线是液相色谱与电喷雾电离质谱联用(liquid chromatography-mass spectrum，LC-MS/MS)的方法对蛋白质复合物进行研究。除此之外，在蛋白质定量研究方面，目前的手段都有一定的使用范围，同位素相对标记与绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQTM)技术已经成为十分成熟可靠的差异表达蛋白质的分析手段。蛋白质组学技术正向着高自动化、高分辨率、高通量的方向发展。

2 蛋白质组学在动物科学上的应用

2.1 肉品质研究

一些研究者致力于用蛋白质组学来描述骨骼肌中蛋白质的种类。Bouley等［6］利用2-DE和MS技术构建了牛的半腿肌蛋白质表达谱，检测到500个可重复的蛋白质点，后来采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的方法成功鉴定了其中 129个蛋白质点。Hatam等［7］用iTRAQTM技术对猪骨骼肌蛋白质表达谱进行了分析，共鉴定了542个蛋白质，并对鉴定的蛋白质表达谱进行亚细胞定位分类分析和对性别和营养因素引起的骨骼肌蛋白质组变化进行了分析。有些研究还对骨骼肌的不同发育时期蛋白质表达差异做了鉴定［8－9］，为研究肌肉形成和发育以及肌间分化奠定了基础。

同时，肉的品质(嫩度、风味、持水力等)也是众多动物科学学者关注的焦点。一方面研究是品种和年龄对肉质的影响:Park等［10］运用2-DE技术在韩国本土黑猪研究中，发现了肌动蛋白α1与嫩度有一定相关性。黄晓毅［11］研究结果表明，金华猪宰后肉品的持水性能、货架寿命、肌肉组织总抗氧化能力显著高于杜×长×大猪肉，并发现与其热休克蛋白及肌间线蛋白高表达有关。Kristin等［12］分别将 6、9、12月龄的纯种挪威长白猪和杜洛克猪屠宰，取大腿内收肌进行蛋白质组学分析，在分析的1 125个蛋白质点中，94个是因为品种引起的变化，41个是因为年龄不同引起的变化。这说明不同的品种和年龄间存在不同的代谢变化和肌肉组成。Mach等［13］也对5种不同品种猪的2部分肌肉进行了比较蛋白质组学分析。

另一方面研究是屠宰后蛋白质的变化:法国学者Lametsch等［14］首先将蛋白质组学应用于猪宰后肌肉组织变化研究中。对猪肌肉组织宰后0～48 h的蛋白质表达谱变化进行比对分析，发现了15个丰度随时间而改变的蛋白质点(这些肌肉蛋白质从5～200 ku不等，pH在4～9)。其中12个蛋白质点的丰度随时间而递增，3个蛋白质点的丰度随时间而递减。随后的研究发现，26种蛋白质与嫩度相关，这些蛋白质被鉴定为肌球蛋白重链(MHC)、肌球蛋白轻链Ⅰ、肌球蛋白轻链Ⅱ等片段，并最终确定了可作为肉质标记的20多种蛋白质［15－16］。在这些标记蛋白质中，发现肌动蛋白和肌球蛋白重链与肌肉的剪切力之间存在显著相关。而Hwang等［17］指出局限于现有的研究，对于肉质到底与哪些蛋白质有线性直接的关联机制还难以下定论。但也发现肌动蛋白及其相关多肽、肌球蛋白轻链、肌钙蛋白、ATP合成酶、热休克蛋白27(HSP27)等蛋白质可以作为肉品质的标记。同时，Jia等［18］在分析宰后牛背最长肌代谢蛋白质组成变化中发现有25个蛋白质点发生了变化，并揭示了代谢蛋白和应激蛋白在宰后呈上调表达。Promeyrat等［19］发现含铁蛋白和抗氧化相关蛋白是蛋白质氧化的潜在标记，并提到如果将蛋白质组学技术延伸到探究硫醇基官能、芳香族氨基酸和脂质等氧化相关物质，可能会更深入地在组织和细胞水平揭示氧化应激的机制，从而更有效地控制肉品质。当然，也有学者研究表明家禽PSE肉［即肉色灰白(pale)、肉质松软(soft)、有渗出物(exudative)］综合征可能与蛋白质的改变有直接关系［20］。但目前对于具体是哪些蛋白质发生了改变以及这些蛋白质如何被修饰还知之甚少。除此，宰后贮藏过程中钙蛋白酶系统对肌纤维蛋白的降解起着重要作用，影响肉的嫩度［21－22］。

肉品质受营养、遗传和环境等共同作用，但是其内在的分子机制人们尚认识不够。蛋白质组学技术为肉品质科学的研究开辟了一条新的思路。利用蛋白质组学技术可以寻找、筛选并鉴定与肉质有关的蛋白质，有望凭借蛋白质组学揭示肉品质形成机制及其与嫩度、风味、持水性的关系。

2.2 乳品质研究

首先，人们对乳蛋白质组成进行了探究。所有物种的乳蛋白质都是以少数几种蛋白质为主要组分。但由于翻译后的修饰和遗传变异，使得蛋白质组变成了一个复杂的体系。所以乳蛋白的组成复杂也为动物科学研究提出了难题，目前Galvani等［23－24］和 Yamada 等［25］分别检测了高丰度和低丰度乳蛋白质，并成功检测出一部分低丰度乳蛋白质。更进一步，杨永新等［26］提取低、中、高体细胞数和临床乳房炎的牛乳蛋白质，分析了不同体细胞数牛乳中乳蛋白质的表达变化。结果显示，牛乳酪蛋白质的水解程度随着体细胞数的增加而增加，至严重临床乳房炎时牛乳中酪蛋白质几乎全部水解而乳清蛋白质急剧增加。

其次，胎次和泌乳阶段也是影响乳蛋白质组成的重要因素。张乐颖等［27］利用LC-MS方法分析了不同胎次不同泌乳阶段奶中乳蛋白质表达图谱，与初产奶牛第1天乳蛋白质表达模式相比，第3胎第1天乳蛋白质表达图谱中表达量上调的有4种蛋白质，但第2胎第21天乳蛋白质表达模式无显著差异。差异表达的乳蛋白质包括免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白 M(IgM)、乳铁蛋白(lactoferrin，LF)和白蛋白(albumin，ALB)。从而为揭示胎次和泌乳阶段影响乳蛋白质表达的机制奠定了基础。采用iTRAQTM技术，将分娩后第7天的乳脂肪球膜蛋白表达模式与第1天分析比较，Reinhardt等［28］发现包括嗜乳脂蛋白、黄嘌呤脱氢酶、脂肪酸结合蛋白等26种蛋白质的表达量上调，阿朴脂蛋白Al等19种蛋白质的表达下调，说明泌乳阶段影响了乳蛋白质组成。

通过饲喂量或营养物质改变乳蛋白质组成，一直是值得研究的方面。Yang等［29］采用2DEMS技术，用D－亚麻酸灌注泌乳奶牛十二指肠，研究其灌注量对乳蛋白质组成的影响，发现当灌注量为0～200 g/d时乳蛋白质组成无变化。当灌注量上升到 400 g/d时，β－酪蛋白 A2、αs1－酪蛋白变异体和ALB含量上升，说明高剂量的D－亚麻酸可引起奶牛十二指肠代谢应激从而改变乳蛋白质组成。对产前奶牛补充用维生素AD3E(V-AD3E)，利用2-DE和LC-MS相结合技术对奶牛乳蛋白组成进行分析，结果发现V-AD3E参与了乳蛋白的合成，提高了初乳中IgG和ALB的含量，并且发现它们的表达量在产后第1天的乳中也上调，但对产后第21天的乳蛋白质表达量没有影响［30］。杨永新等［31］研究了精粗分饲与全混合日粮的饲喂方式对牛乳蛋白质组成的影响，发现饲喂方式对牛奶中主要蛋白质表达没有显著影响。这些都为饲粮因素对乳蛋白质表达的影响机制研究提供了一定的参考。

2.3 蛋品质研究

鸡蛋是胚胎体外发育的所有营养来源和保护屏障，也是人体的必需食品。2006年以来，国内外多位蛋白质组学研究领域专家相继发表论文，对蛋壳、蛋清和蛋黄中全体蛋白质组分进行了鉴定和描述，最终在酸溶性蛋壳基质中发现了520种蛋白质［32］;在蛋清和蛋黄中分别鉴定了 165和255 种蛋白质［33－34］;在蛋黄膜中发现了 137 种蛋白质［35］。

虽然在鸡蛋中发现了如此多的蛋白质，但对于这些蛋白质的具体功能大都还停留在预测阶段。鸡蛋中蛋白质也受多种因素的影响，比如孵化条件、饲养饲粮、储藏条件等。Qiu等［36］对孵化早期的蛋清蛋白质进行分析，发现有8种蛋白质在孵化过程中丰度发生了显著的变化，并确定了30个蛋白质点，并发现存在受温度调控的蛋清蛋白质与转录因子间的相互作用。Wang等［37］对传统白壳鸡蛋、传统褐壳鸡蛋、叶黄素饲养的鸡蛋、有机鸡蛋等6种鸡蛋蛋清进行差异蛋白质组分析，发现6种鸡蛋间有19种蛋白质丰度存在显著差异，并提出品种不同，鸡蛋蛋白质丰度存在差异，蛋白质不存在差异。Dileep等［38］发现了鸡蛋在储藏期间蛋清蛋白质组学的变化，指出储藏期间蛋清中不同蛋白质的丰度发生不同变化，这些变化与蛋清的稀薄化有关。

虽然鸡蛋中被鉴定的蛋白质数量已经大幅提高，但对其实际数量以及不同部位新的蛋白质的探索仍将继续。不同饲粮和孵化条件改变对鸡蛋蛋白质的影响也将是研究的重点。

2.4 其他方面研究

动物机体的代谢由众多mRNA分子表达和密码蛋白质相互作用参与。本质上，mRNA水平的改变将导致蛋白质的改变，由于翻译与转录丰度间无明显相关性，所以二者改变不是平行对等的。同时蛋白质能够动态地反映生物系统所处的状态，所以蛋白质组研究对科学研究具有更大的意义。例如在不同生理条件和营养条件下，利用蛋白质组学研究技术，可以探讨机体蛋白质的变化。除此，蛋白质组学也可以深入而全面地探讨动物生长发育的机制。并且研究一些营养物质和生理调控物质对蛋白质组的影响，寻找反映动物机体营养代谢状况灵敏而特异的标记，揭示营养调控机制也一直是动物科学家孜孜以求的目标。

最近几年，运用蛋白质组学技术探究添加微量元素对机体代谢的影响和肠道健康成为研究的热点。王晓秋等［39］利用差异蛋白质组学，发现与对照组相比，高锌组中有22个蛋白质点表达量上调，其中11个蛋白质点为特异性表达;有22个蛋白质点表达量下调，其中16个蛋白质点特异性消失。主要差异表达蛋白质涉及到能量代谢相关通路、氧化应激相关通路和增殖凋亡相关通路，这些结果证实了氧化锌在一定程度上减缓断奶所引起的肠道上皮细胞氧化应激状况，改善肠道形态和健康。而在肠道健康方面，包括由肠道菌群改变引起肠道蛋白质表达差异［40－41］、饲喂不同蛋白质饲粮引起肠道蛋白质表达差异［42］等。

3 面临的挑战及对策

首先，蛋白质组学技术目前仍然面临巨大挑战。一是细胞的生命活动是通过各种蛋白质来实现的一种动态过程。在不同的细胞周期、分化阶段、生长的营养状况以及环境条件等，机体蛋白质都会发生变化而且差异显著。同时，氨基酸残基数量太多，又加上蛋白质有复杂的翻译和修饰，给分离分析带来许多困难。面对这些问题，需要发展并选用更精准分离技术的同时，加大所研究样本的数量，排除个体间差异，找出群体间差异。二是一般有重要功能的蛋白质的含量是非常少的，蛋白质不能像基因一样在体外扩增，所以少量的蛋白质可能检测不到。由此看来，面对众多具有研究意义的翻译后修饰的蛋白质、多肽的分析及低丰度蛋白质的检测等，可采用样品分级的方法(如亚细胞分级、亲和分级和顺序提取法等)和免疫学方法。顺序提取法的原理是利用蛋白质溶解的差异性，使用不同溶解能力的溶液顺序提取，从而使样品可在双向电泳中范围内检测［43］。免疫学方法是在电泳前加一些植物蛋白质的免疫吸附剂，然后通过低速离心将发生免疫吸附反应的植物蛋白质和免疫吸附剂的联合体除去。这样就大大降低了高丰度蛋白质的含量，从而减少了高丰度蛋白质对低丰度蛋白质的影响。这种方法已经在动物中使用。

其次，蛋白质组学在动物科学研究中的应用也存在诸多问题。一是由于受多方面因素的制约，蛋白质组学在动物科学上的应用只是涉及而不深入，研究结果大多分散冗杂，浮于表面，许多内在联系都没有揭露。因此，在以后的研究中，需要将相关联的数据进行整合分析，并对差异表达蛋白质进行深入研究，使研究结果更有实际价值。二是研究的内容和方向大多相似，没有新意，对低丰度蛋白质和亚细胞结构缺乏探索。因此，蛋白质组学虽是一项新颖有效的工具，但不可滥用，要找对切入点，才能达到科学研究的目的。三是饲养试验中会有许多不确定因素，难免造成误差。所以在设置对照组以及饲养群过程中，尽量减少误差，为得到可靠数据奠定基础。

4 小结

蛋白质组学的研究将在各个方面推动动物营养学的发展，并为畜牧生产提供理论依据。蛋白质组学是分析细胞蛋白质表达的一个新型、有效的工具。总之，蛋白质组学的研究将推动动物科学的发展，并为畜牧生产实际提供理论依据。我们希望在不久的将来，能够运用蛋白质组学技术找到关于动物科学领域的更多信息，为动物科学家深入了解机体代谢机理和通过营养及其他途径改善动物机体代谢提供依据。然而，我们必须铭记，蛋白质组只是一种分析工具而不是解决问题的唯一方法。因此，在科学研究过程中不一定对任何研究进行蛋白质组学分析，因为即使进行了蛋白质组学研究也未必能得出有效的结果。同时，我们必须在运用蛋白质组学技术的同时联合其他技术，更加全面系统的分析原因，才能得到更准确更真实的数据。

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