解淀粉芽孢杆菌及其作为益生菌的应用

张 娟 杨彩梅 曹广添 曾新福 刘金松

(1.浙江大学动物科学学院，杭州 310058;2.浙江农林大学动物科技学院，临安 313000;3.浙江惠嘉生物科技有限公司，安吉 313307)

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为芽孢杆菌属，是一种与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)亲缘性很高的细菌，其在生长过程中可以产生一系列能够抑制真菌和细菌活性的代谢物。2007年公布的解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组测序使得人们对这种具有多种次生代谢物生产能力的芽孢杆菌有了更深层次的认识，促进了解淀粉芽孢杆菌的生物利用。本文旨在就解淀粉芽孢杆菌的生理生化特性、抑菌物质及其作为益生菌的应用等方面进行综述。

1 解淀粉芽孢杆菌的生理生化特性

解淀粉芽孢杆菌可产生多种α－淀粉酶及蛋白酶，与枯草芽孢杆菌在形态、培养特征及生理生化特性方面非常相似;属兼性厌氧菌，菌落在LB培养基上和牛肉膏蛋白胨培养基上呈淡黄色不透明菌落，表面粗糙，有隆起，边缘不规则，在多种培养基上均不产色素;液体培养静止时有菌膜形成;革兰氏染色呈阳性，杆状，可形成内生芽孢，呈椭圆形，两端钝圆，芽孢囊不膨大，中生到次端生，有运动性;水解淀粉和明胶，乙酰甲基甲醇(V-P)试验阴性，硝酸盐还原试验阴性，苯丙氨酸脱氨酶试验、吲哚试验、甲基红(MR)试验、硫化氢试验均为阴性［1－3］。

研究表明，不同的解淀粉芽孢杆菌菌株对培养基成分及培养条件要求不同，但是总体来说维持在一定的范围内，在基本培养基中能够良好的生长，其培养温度一般为31～37℃，培养液pH为中性，180～200 r/min培养时间16～24 h为宜［4－6］。

2 解淀粉芽孢杆菌的抑菌物质

自Johnson等［7］报道枯草芽孢杆菌可以产生抑菌物质以来，国内外学者先后从不同芽孢杆菌中分离得到多种抑菌物质，包括多肽类、脂肽类及抑菌蛋白类等。解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌，在其生长过程中可产生多种抑菌物质，为其在动植物生产中广泛应用提供了可能。

2.1 抑菌蛋白类

Wong等［8］从解淀粉芽孢杆菌 NK10中分离纯化得到对多种病菌具有抑制活性的抑菌蛋白baciamin，分子质量为50 ku，可以使病原真菌的膜通透性增加，降低人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)逆转录酶的活性，同时对肝癌、乳腺癌、结肠癌细胞具有抑制作用。Kim等［9］用30%的硫酸铵溶液纯化，经 Centricon 10浓缩，二乙基氨基乙基(DE-AE)琼脂糖(快速流柱)及Sephacryl S-100凝胶过滤层析得到纯化的解淀粉芽孢杆菌MET0908产生的抗真菌蛋白，经试验发现其对植物炭疽病具有防治作用，十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得其分子质量为40 ku。其作用机理可能是此蛋白质作用于炭疽病菌的细胞壁，进而抑制其生长。

2.2 脂肽类抗生素

Arrebola等［10］用甲醇提取及色谱分析法分析解淀粉芽孢杆菌PPCB004抑菌物质的成分，发现产生的主要抑菌物质为伊枯草菌素A。Hiradate等［11］从桑叶中分离得到1株解淀粉芽孢杆菌RC-2，其细菌培养上清液对桑炭疽病具有预防作用，用高效液相色谱分析分离出7种抗真菌化合物，核磁共振谱(NMR)和快速原子轰击质谱(FABMS)方法分析其化学结构，发现7种物质均为伊枯草菌素，其中化合物7为一种新的伊枯草菌素，β－侧链分子中具有—(CH2)10CH(CH3)CH2CH3基团。Koumoutsi等［12］研究了解淀粉芽孢杆菌FZB42由基因引导、非核糖体合成的生物活性环脂肽的结构与功能，发现产生抑菌效果的主要物质为表面活性物质(surfactin)、芬芥素(fengycin)及芽孢菌素D(bacillomycin D)，两两相互作用共同抑制病原真菌的生长。Souto等［13］从解淀粉芽孢杆菌BNM122代谢产物中分离得到具有抗植物病原真菌如镰孢菌、丝核菌的物质，经核磁共振氢谱(1H-NMR)和薄层色谱分析发现其中含有脂肽类物质及伊枯草菌素类似物。

2.3 其他

2.3.1 大环内酯类

杨桥等［3］分离得到1株解淀粉芽孢杆菌，对其产生的活性物质经分离纯化及化学结构解析，确定其主要成分为大环内酯类抗生素家族(mcrolactin)的一个新成员，与该家族中最早发现的成员macrolactin A相比，其12位碳上的氢原子被第4个羟基取代，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制效果。

2.3.2 寡肽酶

Chao等［14］报道了解淀粉芽孢杆菌23-7A产生的一种新型寡肽酶，其氨基酸序列与酶活性和细菌PepFs(金属肽酶M3系列)类似。

2.3.3 肽类

王英国等［15］从堆肥中分离到1株对尖孢镰刀菌等病原真菌具有强烈抗性的解淀粉芽孢杆菌菌株，将其发酵液分离纯化得到一种抗真菌活性物质，通过红外和质谱方法分析推测该物质为肽类，分子质量为1 498 u，具有很好的水溶性，并且含有甲硫氨酸。

2.3.4 聚酮化合物

Arguelles-Arias等［16］分析了解淀粉芽孢杆菌GA1基因组序列，发现开放阅读框(ORFs)中的8个基因簇参与聚酮化合物的合成，与Chen等［17］发现的解淀粉芽孢杆菌FZB42有关合成聚酮化合物的基因mln、bae及dfn序列一致。

3 解淀粉芽孢杆菌作为益生菌的应用现状

3.1 解淀粉芽孢杆菌在抑制病原菌方面的应用

近年来，不少学者从不同材料中分离鉴定出对其他致病菌具有拮抗效果的解淀粉芽孢杆菌。曹海鹏等［18］从养殖池污泥中分离筛选出1株解淀粉芽孢杆菌G1，对鲟源嗜水气单胞菌S1具有抑菌效果。王选等［19］从健康青年牛的粪便中筛选出1株对痢疾病原菌有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌N-4。姜军坡等［1］从健康牛的粪便中筛选出1株解淀粉芽孢杆菌BN-9，发现其对大肠杆菌有较强抑制效果。Aunpad 等［20］、Kaewklom 等［21］分别从不同食物和土壤中分离得到1株解淀粉芽孢杆菌SP-1-13LM，其产生的一种生物活性肽对金黄色葡萄球菌及单核细胞增生李斯特菌有抑制效果。

Sutyak等［22］从益生菌乳制品中分离得到1株解淀粉芽孢杆菌，其细胞的无菌上清液可以对单核细胞增生李斯特菌、链球菌属及肠道加德菌产生抑菌作用，而对肠道乳酸杆菌不产生作用。范会兰等［23］的研究表明:解淀粉芽孢杆菌能够抑制犊牛腹泻病原菌大肠杆菌。时威等［24］研究了解淀粉芽孢杆菌发酵液对冷却肉的防腐保鲜效果，结果显示，解淀粉芽孢杆菌发酵液组可将冷却肉的保质期延长6～9 d，而且效果优于Nisin，解淀粉芽孢杆菌发酵液对冷却肉中主要污染菌假单胞菌和潜在致病菌单核细胞增生李斯特菌有较好的抑制效果。吕利群等［25］分离得到1株解淀粉芽孢杆菌Sh1，其对引起淡水鱼最常见的真菌病——水霉病的水霉菌有较强抑制效果，动物安全性试验表明，腹腔注射1×108CFU/mL的Shl对草鱼的生长没有任何不良影响。Halimi等［26］研究表明，解淀粉芽孢杆菌GA1能够产生一种新的细菌素amyloly-sin，对在真空包装中低温冷藏的食物中存在的单核细胞增生李斯特菌有抑制作用，试验结果表明，对鸡胸肉接种2×103CFU/g单核细胞增生李斯特菌，4℃储存21 d，储存期间对照组(不添加amylolysin)单核细胞增生李斯特菌呈对数增长，而添加amylolysin的试验组则受到抑制，最终为1.9 ×103CFU/g。Kaewklom 等［21］研究发现，解淀粉芽孢杆菌SP-1-13LM产物amysin(一种细菌素)对博洛尼亚香肠切片中存在的单核细胞增生李斯特菌有抑制效果，与只接种同剂量单核细胞增生李斯特菌组相比，同时接种解淀粉芽孢杆菌SP-1-13LM部分纯化产物及浓度为2×103CFU/g的单核细胞增生李斯特菌组在接种7 d后显著降低博洛尼亚香肠切片中单核细胞增生李斯特菌的活菌数。

3.2 解淀粉芽孢杆菌在环境保护方面的应用

李超等［2］从滇池富营养化水体中分离得到1株解淀粉芽孢杆菌DC1，并探讨了其对鱼腥藻的抑藻效果及机理，发现解淀粉芽孢杆菌DC1菌体浓度越大，对鱼腥藻的去除效果越明显，其主要抑藻机理是通过分泌胞外物质的间接方式起到溶藻作用，该物质具有很强的热稳定性，是非蛋白质类物质。谭文捷等［27］研究了解淀粉芽孢杆菌对水中丁草胺的降解效果，发现丁草胺初始质量浓度越高，其降解速率和降解效率也越高，碱性条件下丁草胺的降解率明显比酸性条件下高，腐殖酸对丁草胺的微生物降解有很大的促进作用。高大响等［4］从鸡粪中分离到1株解淀粉芽孢杆菌，具有除臭作用。

3.3 解淀粉芽孢杆菌在动物生产中的应用

李卫芬等［28］探讨了添加1×105CFU/g复合芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌比例为1∶1)对草鱼生长、肠黏膜抗氧化功能及养殖水体水质的影响，结果表明在饲料中添加芽孢杆菌可改善养殖水质，增强消化酶活性、机体免疫和肠黏膜抗氧化功能，显著促进草鱼生长，并降低死亡率。孙笑非等［29］从新鲜猪粪中分离得到1株解淀粉芽孢杆菌，具有耐酸和猪胆汁的特点。沈涛等［30］研究表明:解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌以1∶1比例混合饲喂草鱼，可显著提高草鱼肠道内容物胰蛋白酶活性和肝胰腺脂肪酶活性，显著提高肠道芽孢杆菌数量，显著降低弧菌和大肠杆菌数量。曹海鹏等［31］研究了水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性，结果表明:解淀粉芽孢杆菌微胶囊实际无毒，对养殖水中氨氮、亚硝酸盐氮、硫化物和pH等理化因子的影响均控制在水产养殖动物的安全浓度范围内，研究结果为解淀粉芽孢杆菌的安全应用提供了重要的科学依据。沈勇涛［32］通过对妊娠及产后哺乳期母猪饲喂解淀粉芽孢杆菌，观察其对母猪微生态的影响以及对初生仔猪微生态及其生长性能和健康状况的影响，结果表明:在妊娠母猪产前10天至仔猪断奶期间在母猪饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌1×107CFU/g可以改变母猪肠道微生态体系，通过母猪微生态的影响可以改变仔猪微生态体系并帮助初生仔猪建立其肠道微生态体系，同时可以显著提高仔猪生长性能，而且在母猪饲粮中添加解淀粉芽孢杆菌可以增加妊娠母猪短链脂肪酸的产生，增加初生仔猪短链脂肪酸的产生，而且仔猪年龄越小，效果越明显。Mallo等［33］研究发现解淀粉芽孢杆菌CECT 5940孢子制剂添加到肉鸡饲粮中可以降低产气荚膜梭菌、大肠杆菌、鼠杆菌等致病菌的数量，增加饲粮中粗蛋白质、粗脂肪及淀粉的消化率。González-Ortiz等［34］研究了解淀粉芽孢杆菌CECT 5940和屎肠球菌CECT 4515(添加量均为0.5×108CFU/g)的混合剂对健康成年狗营养物质消化率和粪便微生物数量变化的影响，结果发现饲喂益生菌制剂的试验组与饲喂基础饲粮的对照组相比，消化率没有显著变化，但粪便中致病菌梭状芽孢杆菌数量显著降低。但Jerzsele等［35］的研究表明:解淀粉芽孢杆菌对人工感染产气荚膜梭菌而引起的肉鸡坏死性肠炎的治疗无显著效果，说明不同的解淀粉芽孢杆菌菌株抑菌能力和作用效果存在差异。

4 小结

目前，国内外研究人员对关于从植物及土壤中分离鉴定得到不同解淀粉芽孢杆菌菌株的报道较多，并且进一步分析研究了其代谢产物，发现对多种植物病原真菌及细菌有较好的抑制效果;也有不少学者从动物粪便及肠道中分离得到新的解淀粉芽孢杆菌，并将其作为益生菌添加剂添加到饲粮中用于动物生产，有较好抑制致病菌的效果，提高动物生产。解淀粉芽孢杆菌作为新的益生菌添加剂具有广阔的应用前景，有必要进一步筛选出更适宜在饲粮中添加的新菌种，使其能作为益生菌在畜牧养殖业中广泛应用。另外目前关于其抑菌机理及促生长等方面的报道并不多，因此还需要进一步进行深入研究，在分子及基因水平阐述作用机理。

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