调节移植干细胞功能促进梗死心肌修复的策略

黄洁,盛祖龙,姚玉宇

(东南大学医学院,江苏 南京 210009)

近年来,心血管疾病已成为威胁人类健康的首要因素。《中国心血管病报告2012》于2013年8月9日公布,报告指出我国心血管病患者人数约为2.9亿,每10 s就有1人死于心血管疾病。因心肌梗死(MI)、心功能不全导致的死亡占心血管病死亡人数的50%以上。这类疾病的共同特征是心肌供血不足、心肌细胞数量减少从而导致心功能低下。由于心肌细胞是终末细胞,坏死后无法再生,因此若病人心脏收缩功能持续降低,最终将演变为终末期心脏病。目前,国际上对终末期心脏病没有很好的治疗手段,主要原因是缺乏针对终末期心脏病病理改变的有效方法[1]。

1 MI的干细胞治疗方法

梗死后的心肌因缺乏增殖分化能力,心肌细胞无法再生,只能由成纤维细胞填充,最终被瘢痕组织替代并且逐步发生心室的重构。现有的治疗包括药物治疗、冠脉介入治疗,这些治疗虽然可以减轻患者的症状,但无法从根本上改变患者心肌细胞数量缺乏的问题,心脏的功能恢复也受到阻碍。近年来,动物实验和临床初期研究表明,通过移植干细胞可以取代受损心肌细胞,并建立新的血管通路而恢复血供,这已成为MI治疗的热点方法。

干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的细胞,既可以产生和自己完全相同的子代干细胞,也可以在一定条件下分化成为各种其他功能的细胞。已有多种干细胞被尝试用于心肌细胞的再生,涉及的干细胞可分两大类,胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞虽可以分化成为心肌细胞参与对心肌的修复，但是存在不易获取以及伦理学方面的相关问题,此外它们在临床上使用的安全性还有待检验。成体干细胞作为自体细胞,虽然在分化潜能上不如胚胎干细胞,但是却是一种非常适合移植的细胞。现已被证明能够诱导心肌修复的成体干细胞有骨髓干细胞[2]、骨骼肌成肌细胞、心肌干细胞和心脏祖细胞。

2 干细胞疗法面临的问题

尽管已经有了这些适合的移植细胞以供选择,干细胞移植在治疗MI方面也显示了传统疗法不可以比拟的优越性,但在干细胞治疗MI的进程中还存在诸多需要解决的问题。比如：心脏组织特异性干细胞的寻找以及分离培养的技术问题;经过体外分离培养的干细胞是一类具有多向分化能力的细胞,它们是否存在基因突变,植入机体后是否有发生癌变的可能性等。

此外将干细胞移植入梗死心肌,还面临着移植细胞大量死亡的问题。研究显示,移植1周后的细胞存活率低于10%,这大大降低了细胞治疗的预期效果。造成移植后细胞死亡的原因是多方面的,如宿主炎症反应、机械损伤、适应不良、缺血或缺血再灌注损伤、细胞凋亡以及干细胞来源和质量等[3]。因此,针对这一难题,我们对提高干细胞在移植后的缺血环境中生存的方法进行了深入的探讨。

3 促移植干细胞存活的策略

3.1 缺血预适应(IPC)

研究发现对心脏进行短暂缺血再灌注能够减轻心肌细胞损伤,提高心肌细胞对长时间缺血损伤的抵御能力,具有细胞保护效果。对心肌重复进行每5 min1个周期的间歇性缺血再灌注能够显著缩减心肌梗死面积,并且能够激活细胞内的生存信号,此方法被称为IPC。通过对细胞进行IPC而促进细胞存活已成为一种很有潜力的细胞保护策略[4]。

虽然IPC对心肌的保护作用已得到广泛的认可,但是它的机制仍未被完全阐明。目前认为,此机制的信号转导过程包括“触发物质(内源性活性物质)- 中介物质(蛋白激酶)- 效应子(离子通道和保护蛋白)”3个环节。

首先缺血刺激可诱导机体释放大量的内源性活性物质,如腺苷、儿茶酚胺物质、缓激肽[5]、罂粟碱以及一氧化氮(NO)。这些物质的表达水平与预适应刺激的强度以及持续时间有关,它们可以作为触发因子引起后续一系列的反应。随之,活性物质与受体结合后活化的蛋白激酶发挥中介效应。研究发现蛋白激酶C(PKC)[6]是一种重要的调节激酶,在IPC细胞信号转导过程中发挥作用。另外,其它多种蛋白激酶,包括酪氨酸蛋白激酶(Src)、磷脂酰肌醇3- 激酶(PI3K)、P38 丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)和Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK /STAT)通路也可作为中介物质参与到IPC过程中[7]。

最后整个信息转导通路终止于能够产生终末效应的离子通道。心肌纤维膜上的ATP依赖钾离子(KATP)通道就是信号转导途径中终末效应物质之一,在预适应的急性时相中发挥作用[8]。近期研究也显示,在IPC或者化学药物诱导的预适应中,线粒体的KATP通道不仅可以作为终末效应子,还能作为中介物质发挥作用[9]。

此外,IPC的延迟保护作用与新生蛋白质的合成有关,诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)与这一保护作用关系密切。后续的研究也已表明,IPC能够动员起内皮祖细胞表达出一系列的有潜在心肌保护作用的细胞因子,NOS就是这些细胞因子中的一员[10]。同时,IPC能够显著提高细胞对氧化应激的抵御能力和细胞移植的植入水平[11]。

预适应细胞提高了细胞分化潜能和旁分泌活力,多数研究认为细胞缺氧和低氧预适应能够提高细胞的存活率,有利于MI后心脏修复,因此在移植前对干细胞进行缺血预处理是一种提高干细胞疗法有效性的措施[12]。

3.2 药物预适应

因为IPC应有一定创伤性,并存在一些潜在危险因素，导致它难以在临床上推广使用。但其细胞保护效应还可以通过其他一些方式来模拟,如药物预适应。药物预适应是指预先用具有刺激作用或轻微损伤作用的药物处理,激发或者模拟机体中的内源性物质,如腺苷、缓激肽、前列环素(PGI2)、NO等,以调动机体对后续长期有害刺激(如缺血、缺氧等)的抵抗力。

已知通过激活线粒体通道促进细胞存活是一种内源性反应,也是自稳态调节机制的一部分[13]。这种效应可通过药理性干预模仿完成,从而提高移植细胞的存活率。研究发现,应用KATP通道开放剂,如二氮嗪、吡那地尔,可以促进钾离子大量涌入KATP通道,激活自稳态调节系统,保护植入的细胞[14- 16]。

基于大鼠的缺血再灌注损伤研究显示,用KATP开放剂二氮嗪预处理心肌细胞能够降低血清心肌酶含量、减少MI面积、维护心功能,减轻损伤。其机制可能是二氮嗪作用于KATP并开放通道,使钾离子、水分子内流,导致线粒体基质肿胀,呼吸功能增强,防止线粒体的钙超载[17- 18]。相反,若使用KATP通道抑制剂5- hydroxydeeanoate(5- 羟葵酸盐)可以去除二氮嗪对心肌细胞的保护作用[19],进一步证实了二氮嗪对缺血心肌的保护作用。

近期研究中,经二氮嗪处理的间充质干细胞能通过核因子-κB活化而提高细胞生存率,同时使得PI3Κ、 蛋白激酶B(Akt)、糖原合成酶激酶- 3β(GSK3β)和核转录因子p65(NF-κB p65)的磷酸化作用增强[20]。使用Wortmannin(渥曼青霉素,PI3K特异性抑制剂)、小分子多肽(NEMO- binding domain,NBD)、或NF-κB p50 小干扰RNA(siRNA)可以去除NF-κB p65的激活导致细胞生存下降。

除了生存信号通道的激活,药物预处理干细胞还能引起预适应的细胞以旁分泌方式释放生长因子和细胞因子,从而保护细胞、促进新生血管生成。此现象进一步支持了预处理诱导的信号通路中的“分泌假说”。研究发现,经过预处理的干细胞中,一些可溶性的生长因子释放显著增多,比如血管内皮生长因子(VEGF)、基质细胞衍生因子(SDF- 1)、干细胞生长因子(HGF)及胰岛素样生长因子I(IGF- I)。在一个实验研究中,通过对预适应后的骨骼肌细胞进行以PCR(聚合酶链反应)为基础的生长因子分析显示,预适应能使骨骼肌细胞中的白介素11(IL- 11)以自分泌或者旁分泌形式产生,从而促进细胞生存[21]。这些实验都清楚地表明用药物适应细胞后不仅能激活KATP通道,而且能启动多重分子机制,拮抗氧化应激对细胞的损伤。

药物预处理表现出较好的可控性和重复性,并且此种处理方式相对于缺血预处理显示了更小的毒副作用。实验对象对这种预处理方式也表现出很好的耐受,因此药物预适应具有良好的临床应用前景,更易在临床上进行推广。

3.3 基因修饰干细胞

基因修饰是利用分子克隆技术操作目的基因,并改变生物遗传性状的过程。即采用类似工程技术的方法在体外进行基因重组,让该宿主细胞具备过表达或者静默表达某种基因的能力,从而改变宿主细胞原有的功能性状。基因修饰主要使得干细胞过表达相关蛋白,有助于提高细胞移植效率、保护心脏功能和协助体内示踪等。研究发现可以对细胞移植的各个阶段开展基因修饰,从而解决细胞移植治疗难题,促进细胞早期存活并快速有效地归巢。

3.3.1 提高干细胞存活能力 B淋巴细胞瘤- 2(Bcl- 2)基因家族是与细胞凋亡相关的一类蛋白质,它可以抑制细胞凋亡,延长细胞生存时间。用Bcl- 2修饰过的干细胞在移植入梗死区域后存活率有显著提高,心肌梗死面积减少,心功能明显提高[22]。

研究显示Akt在调节各种生长因子或者刺激其他因素诱导干细胞存活、增殖以及物质代谢等方面发挥重要作用。用Akt基因修饰间充质干细胞(MSC)后,将其注入到梗死心肌模型内,发现Akt- MSCs比未修饰过的MSCs具有更强的抗凋亡能力,移植后的凋亡率下降了80%,分化为心肌样细胞的数目明显增多,梗死区面积显著减小。由此可见,Akt修饰干细胞,能有促细胞存活的功效[23]。

3.3.2 促进新血管生成,改善生存环境 因为血管发生粥样硬化从而引起心肌细胞的坏死,最终导致缺血性心脏病的发生。如果能够促血管生成,提高血管密度,建立侧支循环,恢复血供,改善干细胞和周围心肌细胞的微环境,便能大大减少细胞死亡,对治疗MI也有极其重要的推动作用。血管生长因子可以通过刺激内皮细胞生长和迁移诱导血管生成,促进相关组织的生长和修复。VEGF是被广泛研究的血管生长因子中的一种。外源性VEGF可促进血管生成、增加缺血区灌流、抑制内皮细胞凋亡、促进受损血管内皮愈合、抑制其下的平滑肌层病理性增厚、促进内皮依赖的血管舒张并可减少心肌缺血再灌注损伤。研究发现,如果将VEGF基因转染干细胞可以提高干细胞治疗缺血心肌的疗效。过表达VEGF的单个核细胞在移植后能够显著增加侧支血管及毛细血管的密度,并且显著提高左心室功能[24]。目前,血管生成生长因子通过促进侧支循环生长治疗缺血性心脏病,为不能选择传统血运重建治疗的患者提供帮助。

3.3.3 改善血管顺应性 NO在心血管疾病治疗中起重要作用。NO具有调节血压、扩张血管、抑制血小板聚集和白细胞黏附、抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。NO是被NOS催化而成,共有3种不同的NOS如内皮型eNOS、神经型nNOS和诱生型iNOS，其作用也各不相同。eNOS主要存在于内皮细胞中,是钙离子和钙调素依赖性酶,但是其活性维持非常短暂,催化的NO量也较少。所以如果能对移植细胞进行eNOS的基因修饰,成功表达eNOS重组蛋白,便可大大提高催化的NO量。

最新研究结果显示,eNOS基因转染MSC能安全有效地改善小型猪MI后心功能[25]。对其机制的研究认为eNOS可增强血管顺应性,使得血管保持通畅[26]。同样也发现,若将eNOS转染到内皮祖细胞上可以起到帮助细胞迁移、促分化的作用[27]。NOS/NO系统在心血管疾病中有着重要地位,对NOS/NO的干预也成为了心血管疾病治疗的新靶点。

3.3.4 增强干细胞趋化归巢作用 许多生长因子有促细胞向心肌归巢的能力,不同的生长因子能够对不同类型的干细胞起动员作用。比如SDF- 1可以动员心脏干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞以及特异性表达趋化因子受体CXCR4的间充质干细胞[28],而单核趋化因子3(MCP- 3)在MI后24 h升高达36倍,并在促进多种干细胞动员及归巢中起重要作用[29- 30]。在急性MI发生后缺血区域生长因子富集,从而动员干细胞定位到损伤的心肌组织周围进行修复,但是各种因子参与修复过程取决于即刻浓度、相互交错存在的多态性及协同和拮抗作用。由于这些因子的表达时间非常有限,所以可以通过基因修饰方法对细胞进行处理,使得相应的生长因子在心肌组织内过表达并且延长其表达时间。SDF- 1α/CXCR4受体/配体系统广泛分布于生物体内,参与细胞的生长增殖、生存和抗凋亡以及迁移、转录活性。研究表明,通过基因修饰延长SDF- 1在心肌组织中的表达时间,可以诱导移植细胞定位,提高血管密度,激活并动员自体心脏干细胞,改善心功能。

同时也发现如果在移植前对MSC进行处理,将细胞表面的CXCR4受体作为预适应的靶点,然后通过SDF- 1α/CXCR4受体/配体的相互作用可提高供体细胞的定位,具有改善心功能的效果[31]。因此,无论是对内源性细胞过表达细胞因子,还是对外源性植入细胞进行过表达相关细胞因子的受体,都可以起到定向动员作用,从而提高治疗效率。

3.3.5 多基因修饰干细胞 随着基因修饰干细胞的研究不断发展,为了进一步提高干细胞的性状,人们提出多基因修饰干细胞的设想。实际研究发现,基因修饰干细胞联合过表达一个或多个生存信号分子可以达成这一目标。例如,血管生成素- 1(Ang- 1)是一种有效的血管发育调节基因,当它与相关受体结合后可以激活Akt生存信号通路,预处理MSC可显著提高其抗凋亡能力,从而显著改善心功能[32]。如果在间充质细胞上联合过表达Ang- 1和Akt能使细胞在植入梗死大鼠心肌后更好存活,两者的联合效果要优于独自单一的过表达效果[33]。此外,Akt和Ang- 1共转染MSC,能促使大鼠MI后毛细血管和小动脉显著增生并在3个月内显著改善心功能[34]。

4 总 结

干细胞移植治疗是目前治疗心血管疾病的热点,虽然相对于传统方法它有着巨大优势,但移植后的细胞大量的丢失是其面临的最棘手的问题。移植后严峻的微环境使细胞难以存活,大量的细胞死亡又进一步激发免疫和炎症反应而加剧微环境的恶化,如此反复形成恶性循环。因此,当务之急就是优化细胞移植环境,并且在移植前对细胞进行干预来承受移植后的严峻考验。现阶段已有许多手段可以提高干细胞治疗的效果,包括IPC、药物预适应、基因修饰干细胞。但它们各有其优缺点,所以我们需要对这些细胞保护方法进行更深入的研究并应用到临床,从而提高干细胞治疗心血管疾病的效果。

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