利用荧光激活细胞分选技术获取荧光蛋白标记肾小球足细胞

付　佳　何慈江　刘志红

足细胞是肾小球中具有重要功能的一类细胞，足细胞损伤参与多种肾脏疾病的发生发展过程。阐明足细胞损伤及修复机制是当今肾脏病研究的一个重要领域。然而，目前足细胞研究大多采用体外培养的足细胞系，由于体外细胞培养的环境可改变细胞生物学特性，因而并不能客观的反应其在体内的实际状态，限制了对足细胞的研究[1]。由此，近年来更多的研究致力于寻找从动物体内提取足细胞的方法。为弥补现有的技术因不能获得满足基因组学研究水平的产量和纯度而未得到广泛应用的不足[2,3]，基于流式细胞仪的荧光激活细胞分选(FACS)技术应运而生。

流式细胞仪是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的高效检测仪器，提供生物粒子大小、结构及荧光强度等信息。其应用范围非常广泛，其中细胞分选技术就是它的重要应用之一。细胞分选技术可根据细胞的特性将其从混合样品中分离出来，目前常用的分选技术包括单细胞分选(IsoRaft Array，DEP Array)、密度梯度离心法、免疫磁珠法及流式分选法(FACS)。与传统分选方法相比，流式分选法具有极高的精确度和速度，可同时进行阴性和阳性选择，甚至多路分选，且不受限于表面抗原，可根据任何能检测到的发光度(如细胞体积)或荧光(DNA、RNA或蛋白含量，酶活性，特异抗原)散射度差异来分离细胞[4]。流式细胞仪通过极细的鞘液包裹推动单细胞/微粒排成单列待测细胞经过流动室喷口后断裂为均匀液滴，根据每个细胞经过待测点时光信号的变化来判断该细胞的大小、形态及荧光强度，并充以正、负不同的电荷，使其流经偏转板时可在高压电场的作用下偏转，分选入各自的收集容器，从而实现细胞的分离。

国内现有的细胞分选技术主要应用于培养的细胞系，对于制备新鲜实体组织单细胞悬液尚无广泛应用。本实验采用的荧光标记转基因小鼠具有在特定组织或细胞类型中稳定表达荧光的转基因株，相较于传统动物模型，可在发育的各个时期及不同疾病状态下方便地观察到荧光标记细胞，避免了应用特定表面抗体包被分选细胞时抗体效价低的缺陷，是进行活体细胞分选的理想模式动物。

材料与方法

实验动物红色荧光蛋白报告基因小鼠(IRG)[B6;C3-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J]及足细胞特异hNPHS2-Cre重组酶小鼠购于美国杰克逊实验室。小鼠饲养于特殊无病原体，自由饮水，饲料为繁殖用固性饲料，SPF 动物实验室。12h照明、12h黑暗交替环境。实验小鼠均采用聚合酶链反应(PCR)进行基因型检测。所有动物实验均按照美国生理学会实验准则进行。

实验方法

肾小球提取与制备应用Takemoto[2]曾报道过的磁珠分离法提取8w红色荧光蛋白报告基因小鼠肾小球。将小鼠麻醉后置于解剖显微镜下，由一侧肾动脉缓慢灌注4 ml 37℃预热磁珠溶液及1 ml含消化酶的磁珠溶液。取下肾脏后用刀片将其切割至1 mm3大小，加入3 ml 消化液后在37℃孵箱孵育15 min。消化过程中每5 min用枪温和吹打，加速消化，其后所有操作步骤置于冰上或4℃。消化至无团块组织，取出EP管，消化后肾脏通过100 μm细胞筛，除去未解离组织，取4℃ HBSS溶液广泛清洗流经分子筛的消化组织，1 500 r/min普通离心5 min。吸去上清及中间磁珠层，仅留下细胞沉淀，加入2 ml HBSS溶液重悬细胞。2 ml EP管置于磁性微粒浓缩器，吸去上层清液，HBSS两次清洗吸附在富集器上的肾小球。

单细胞悬液制备加入2 ml消化液重悬肾小球，2 000 r/min在37℃恒温混匀器中孵育40 min。消化过程中，每5 min用移液管温和吹打混匀，荧光显微镜下检查消化效率。消化后溶液再次置于磁性微粒浓缩器，留取上清液，去除吸附的磁珠及无足细胞的肾小球剩余结构。取上清液经分子筛滤过至50 ml falcon管中，1 500 r/min离心5 min。吸去上层清液，仅留取管底细胞，最终加500 μl HBSS重悬得到单细胞悬液用于流式细胞分选。

荧光激活细胞分选(FACS)单细胞悬液中加入二脒基苯基吲哚(DAPI)荧光染色判断细胞活力。单细胞悬液通过BD AriaII在488 nm波长激发光下分离绿色荧光蛋白阳性(GFP+)和GFP-细胞。上样后调节细胞流速始终维持在2 500 events/s 左右。根据目标荧光标记细胞的大小和颗粒度选定Forward Scatter(FSC)和Side Scatter(SSC)范围。以野生型自发荧光强度为基准，确定收集细胞的荧光强度范围，设定仅DAPI阴性细胞可被分选(380 nm波长激发)。荧光细胞直接收集至装有300 μl细胞裂解液的螺帽管中，每管收集约150 μl 细胞HBSS 悬液(约3×105个细胞)。

RNA提取和实时荧光定量PCR在不含RNA酶环境下经苯酚-氯仿法提取RNA，制备过程最后用DNA酶消化处理。RNA经Agilent 2100 Bioanalyzer质检后核糖核酸(RIN)指数在9.5～10范围用于后续实验。提取RNA经Ambion WT expression kit反转录成cDNA,随后用MESA FAST qPCR kit进行SYBR分析。小鼠nephrin,podocin,synaptopodin,pecam1,cdh5引物序列见表1。

表1　小鼠足细胞标志蛋白引物序列设计

结　　果

IRG报告基因小鼠荧光表达情况本实验所使用的IRG，与Cre重组酶结合前可在全身各组织广泛表达红色荧光蛋白，而和组织特异性Cre重组酶结合后则在特定组织表达增强绿色荧光蛋白(EGFP)[19]。观察8w 成年IRG小鼠，在荧光显微镜下即可见红色荧光蛋白在全身各组织均有表达。继而将此转基因小鼠与hNPHS2-Cre小鼠杂交，利用共聚焦显微镜观察新鲜分离所得肾小球，可见肾小球中同时有GFP和红色荧光蛋白表达(图1)，其中存在GFP细胞阳性表达的肾小球占总量的80%。经免疫荧光证实，肾小球中GFP的表达与足细胞标志蛋白synaptopodin表达共定位(图2)。

图1　IRG转基因小鼠中荧光蛋白表达标记(8w新鲜分离肾小球，×63)

图2　肾小球中绿色荧光蛋白(GFP)的表达和足细胞标志蛋白synaptopodin表达共定位(IF，×63)

绿色荧光标记细胞分选经两次消化后获得单细胞悬液，上样后根据流式细胞仪FSC及SSC参数选取细胞集中区域。首先选取FSC作阈值，排除样品中各种碎片及鞘液中的小颗粒，避免对被测细胞的干扰及纯度影响(图3A)。其次，通过DAPI免疫荧光强度，鉴定并排除已死亡细胞(图3B)。通过绿色荧光(FL-GFP)参数可知细胞的荧光信号强度，与野生型单细胞悬液样本对比可见一群SSC值大且FL-GFP值高的细胞，即为转基因小鼠中GFP标记细胞(图3C)。选取该组细胞即可成功进行荧光标记细胞分选，该GFP平均荧光阳性率为14.93%，与所报道足细胞占肾小球细胞比例基本一致。在选取过程中，适当提高FL-GFP阈值可避免细胞自发荧光对分选的干扰，进一步提高分选纯度。

图3　A：运用Forward Scatter(FSC)和Side Scatter(SSC)参数选取分选细胞群示例；B：运用DAPI荧光值参数选取活细胞群示例；C：报告基因小鼠肾小球中荧光蛋白表达水平

分选细胞基因表达情况鉴定在流式细胞分选过程中分别收集高荧光信号和低荧光信号的细胞作为对照，同时提取RNA后逆转录为cDNA,采用qPCR方法检测足细胞表面标记蛋白nephrin,podocin,synaptopodin及内皮细胞标志物Pecam1,cadh5表达情况。结果可知，在GFP高表达细胞中，足细胞表面标记物的mRNA表达明显高于对照组(P<0.05),其中synaptopodin表达明显增高；而内皮细胞表面标志物mRNA明显低于GFP低表达肾小球细胞(P<0.001)(图4)。

讨　　论

近十年来对足细胞生物学的研究不断深入，尤其随着足细胞特异性表达蛋白分子的相继发现，足细胞已被认为是参与各种原发性或继发性肾小球疾病进展的关键细胞[20]。 足细胞特异性调控基因表达的Cre重组酶与反转四环素反式作用转录因子(rtTA)的发现更加速了对足细胞的深入研究。Cre重组酶广泛存在于大多数转基因系的细胞或特定组织中，这使得研究胚胎发育中某种细胞的谱系追踪和特定组织的基因敲除技术得以广泛开展。当应用于谱系追踪时，通常将表达Cre重组酶的谱系与报告基因谱系杂交，通过诱导表达Cre重组酶激活报告基因。

图4　分选GFP+和GFP-细胞足细胞和内皮细胞表面标志物mRNA表达情况

目前，已报道诸多报告基因谱系[5-15]。然而这其中多为单一报告基因谱系，即靶向定位于ROSA 26和LacZ或各种荧光蛋白。单一报告基因谱系最显著的缺陷在于报告基因的表达仅发生在Cre酶切作用之后，因此当报告基因表达减弱时，并没有良好的内参对照来区分其源于报告基因自身表达改变还是广泛表达的启动子失活。在此基础上，双重报告基因谱系应运而生。该谱系在与Cre重组酶结合前即可稳定表达某种报告基因，当酶切作用发生后方可激活第二种报告基因[15]。这种双重报告基因的优势在于，始终有某一报告基因可持续表达于单个细胞中，保证了内参对照的存在。本实验所选择的红色荧光蛋白报告基因小鼠IRG[16]，与Cre重组酶结合前可在全身各组织广泛表达红色荧光蛋白。当该小鼠和组织特异性hNPHS2-Cre重组酶结合后，在特定组织中Cre可产生酶切作用激活第二种报告基因，从而表达EGFP。而哺乳动物中，hNPHS2仅在肾小球足细胞中具有特异性表达，常被用于该区域的分子标记。因此，本实验通过构建双重荧光蛋白标记小鼠模型，可实现对hNPHS2表达细胞的荧光标记，建立适用于小鼠足细胞的分选方法，为获得更可靠的新鲜分离足细胞转录谱研究奠定基础。

尽管如此，研究足细胞在疾病发病中的分子机制等领域仍受到诸多限制，现有的技术由于不能获得满足基因组学研究水平的产量和纯度而未得到广泛应用。为改善新鲜分离足细胞产量低的不足，许多的研究试图使用原代培养或永生化足细胞[17]。然而这种做法存在许多公认的劣势。主要原因如下(1)足细胞是高度特异性、终末分化的上皮细胞。细胞培养的环境可快速改变其细胞生物学特性，终末分化、有丝分裂后的细胞去分化并开始再次分裂。不同的培养条件可导致不同的结果，更重要的是，诸如裂隙隔膜这类分化足细胞的重要标志，在体外培养的环境下并不能形成；(2)在大多数疾病模型中，体外培养的足细胞不可能复制体内疾病环境。

目前现有的实验技术尚不能获得满足基因组学水平要求的足细胞，成为目前阻碍足细胞研究的主要难题。肾小球三种固有细胞——系膜细胞、内皮细胞、足细胞之间的紧密连接加大了从生物样本中分离足细胞的难度。由于在人和小鼠体内，肾小球体积占肾总质量的比例小于5%，而足细胞又仅存在于肾小球，因此本实验采用的首先提取肾小球的方法可相对富集足细胞。目前，在人和大鼠中广泛应用的筛分技术可提取纯化率高达90%肾小球[20]，针对小鼠则多使用磁性颗粒灌注后磁珠分离法[21,2]。尽管如此，肾小球中足细胞周围邻近存在的系膜细胞和内皮细胞也限制了对于足细胞特有功能的研究。在此基础上，Murakami等[22]和Akilesh等[23]应用足细胞特异性抗体(如nephrin,podocalyxin)，从细胞悬液中分离足细胞及非足细胞。此种方法很大程度上受限于所使用抗体的特异性，因此存在产量低、效率低的劣势。此外，如果分选细胞的特异性标志物位于细胞内，可能因为染色标记时所需的透化步骤导致细胞膜破裂，细胞死亡。为加以改进，本实验应用仅在足细胞特异表达GFP的转基因老鼠，利用酶消化法进一步分离肾小球，由FACS技术从获得的单细胞悬液中分离足细胞。针对以往方法中存在的分离细胞产量低的不足， 本实验进行了如下改进：(1)将原有实验方法中的心脏灌注改为肾动脉直接灌注，这种方法避免磁珠进入体循环产生无效灌注，同时节约了磁珠的使用量；(2)改进消化液配方，加用蛋白酶E及脱氧核糖核酸酶1，提高消化效率，尽量减少分离肾小球在37℃消化时间，避免酶消化引起的细胞分子表型和基因表达的改变。在此基础上，提纯产量较之以往增加2～3倍，结果显示平均每只小鼠可获得大于3×105个足细胞，此产量可满足转录谱及定量蛋白组学研究。

尽管本实验所用提纯分离足细胞的方法在某些方面优于以往报道的方法，但是仍不能忽视其中可能存在的问题。首先，由于荧光激发分选仪(BD,AriaII)在红色荧光处激发波长并不能精确探测本实验所涉及的红色荧光蛋白，因此在分选时红色荧光高值区域比实际肾小球非足细胞比例低。其次，目前使用的所有提纯足细胞方法均需在37℃下酶消化，分离肾小球及其周围非肾小球结构，从而将足细胞从非足细胞肾小球细胞中分离出来。众所周知，机械损伤和酶消化均有可能在分离过长中改变足细胞的分子表型。与现有方法相比，本实验设计将细胞在37℃消化时间由1.5h缩短至55 min，实验全过程从处死小鼠至冻存分选后的细胞沉淀由原来4h减少至2.5h。针对流式细胞分选过程，所有待分选样品均在4℃保存，尽可能缩短置于室温至单细胞悬液上样分选的时间。遗憾的是，目前尚无任何更优化方法可省略酶消化步骤而将足细胞从其自然三维环境中分离出来[2，4，5]。另外，足细胞标记的转基因小鼠的培育需要花费大量的时间及经费，尤其是在研究疾病模型时仍涉及遗传变异等问题(糖尿病模型的db/db小鼠[24]，CD2AP基因敲除小鼠[25])。然而，与依靠抗体进行低效率磁激活的细胞分选法相比，使用转基因模型所获得高产量、高纯度足细胞仍不失为一种更有效的方法。

小结：应用FACS技术可有效的从荧光标记小鼠中提取高纯度足细胞，其产量和纯度为进一步开展足细胞基因组学、蛋白组学水平研究奠定了基础。

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