瞬时受体电位通道蛋白6参与血管紧张素Ⅱ诱导足细胞损伤的信号传导机制

蔡佳盈　沈世忠　综述　万建新　审校

近年的研究表明血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)通过其AT1受体(AT1R)导活性氧(ROS)的产生[1，2]，活化瞬时受体电位通道蛋白6(TRPC6)并增强TRPC6的核转录，上调及活化的TRPC6通道可增加Ca2+内流并介导足细胞肌动蛋白骨架的重排致足突融合、参与足细胞损伤及凋亡的发生、发展。本文分别阐述足细胞TRPC6通道、Ang Ⅱ上调及活化TRPC6通道、上调及活化TRPC6通道在Ang Ⅱ致足细胞损伤及凋亡中的作用。

足细胞TRPC6通道

经典型TRPC是存在于哺乳类动物细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道。该家族总共有7个亚型， TRPC为同源或异源四聚体蛋白，含有6个跨膜亚单位，一些TRPC(包括TRPC6)其细胞内氨基端和羧基端可结合钙调素。G蛋白偶联受体(GPCR)及受体酪氨酸激酶活化后，参与细胞内Ca2+浓度的调控。在TRP家族中，TRPC6亚型被认为是选择性最强的通道蛋白，通过介导Ca2+内流而发挥生理作用[2]。在肾脏生理进程中，该通道涉及肾小管Ca2+和Mg2+的重吸收，渗透压调节等。足细胞表达的TRPC6可相互结合在胞膜形成同型或异型四聚体离子通道。2005年，Winn等[3]首次发现在家族遗传性局灶节段性肾小球硬化(FSGS)患者中存在TRPC6基因突变，并且TRPC5和TRPC6被认为是足细胞中的Ca2+内流通道，而TRPC6对Ca2+的通透是无限的，因此TRPC6介导的Ca2+内流活化下游信号分子也是充足的，故可理解为信号整合及放大器。TRPC6亦属于足细胞裂孔隔膜蛋白，免疫共沉淀法显示TRPC6和裂孔隔膜蛋白nephrin及podocin紧密联系，提示TRPC6可能涉及裂孔隔膜的信号传导[4,5]。

Ang Ⅱ通过AT1R介导足细胞损伤

已证实大部分肾脏细胞，包括足细胞、系膜细胞及肾小管上皮细胞可产生Ang Ⅱ[6,7]，肾素-血管紧张素系统(RAS)在调节心肾功能发挥重要作用，但是，过多RAS活化将促进炎症和氧化应激，导致肾小球滤过屏障损害和蛋白尿[8]。关于Ang Ⅱ可直接损害足细胞不断得到认可[6]。Ang Ⅱ作为肾脏病进展的危险因素，可诱导产生大量非血流动力影响，如产生氧自由基、细胞因子，并可刺激细胞凋亡、增生和肥大[9]。Ang Ⅱ可影响裂孔隔膜复合物基因的表达，如nephrin和podocin、TRPC6等。很多作用主要是通过AT1R介导的[10]，早在2004年Hoffmann等[11]在转基因小鼠研究中证实，足细胞AT1R过表达足以导致蛋白尿和FSGS。AT1R通过与异源三聚体G蛋白结合激活不同第二信使介导的转导通路[12]。

Ang Ⅱ活化TRPC6并增强TRPC6的核转录

Ang Ⅱ活化下游TRPC6最近，电生理学详细揭示了TRPC5和TRPC6作为Ang Ⅱ诱导非选择性阳离子传导的下游离子通道[13]。TRPC5和TRPC6可被上游的受体活化，如GPCR，包括AT1R。Ang Ⅱ在多种酶[如黄嘌呤氧化酶、细胞色素P450、一氧化氮合成酶(NOS)、黄素氧化还原酶]参与下通过其AT1R介导ROS的产生[1]。在足细胞中，Ang Ⅱ与酶之间的联系及上调信号分子调节还原型烟酰嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶机制尚不完全清楚，可能有磷脂酶D(PLD)、蛋白激酸C(PKC)、非受体酪氨酸激酶(c-Src)、表皮生长因子受体(EGFR)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和Rac的参与。ROS为高活性分子，它可氧化脂质、促进内皮NOS解偶联从而减少NO的合成[14]，局部组织ROS还可将局部释放的NO转化成ONOO-,ONOO-极易与蛋白质酪氨酸残基作用生成3-硝基酪氨酸(3-NT)[14]，NO减少、ROS增多被认为是脂质、蛋白质和DNA氧化损伤的主要原因。体内实验证明，Ren2小鼠给予ROS清除剂、AT1R阻滞剂可降低肾组织内NADPH活性，减少ROS的生成，减轻足突融合[8]。ROS的增加降低了NO的生物活性，NO是RAS作用于肾脏的关键调节分子[7]。NO能够激发细胞内多种信号转导通路，刺激可溶性鸟苷环化酶催化细胞内环磷酸鸟苷(cGMP)的合成，再由cGMP激活蛋白激酶G(PKG)调节局部和全身信号。PKG存在于多种组织细胞，是重要的信号分子NO的下游底物，能够在多种水平调节Ca2+水平。故考虑足细胞是否存在NO-cGMP-PKG信号通路并通过该通路激活TPRC6通道，尚待进一步证实。TRPC6还可被Ang Ⅱ活化的AT1R及其下游第二信使二酰苷油(DAG)所激活的蛋白激酶C活化[17]。

Ang Ⅱ增强TRPC6的核转录Ang Ⅱ活化TRPC6并增强其核转录[18,19]。在心肌细胞中，Ca2+无疑被认为是导致心脏肥大的原因之一，Ang Ⅱ活化TRPC6和Ca2+依赖钙调磷酸酶、细胞活化T细胞核因子(NFAT)的正反馈环，导致TRPC6转录增加及心肌肥大[20]。而在小鼠足细胞中，Tom Nijenhuis等的研究也显示Ang Ⅱ可诱导TRPC6表达和足细胞损伤，TRPC6通过PLC相关转导信号被活化、钙离子内流、钙离子依赖的钙调磷酸酶活化进一步导致NFAT核转录而增强TRPC6相关基因的表达，足细胞细胞膜TRPC6表达增多将导致这一正反馈调节。这正反馈调节导致钙调磷酸酶的持续活化和TRPC6的进一步表达[21]。该作者为了进一步证实上述观点，用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)与血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)处理Ang Ⅱ活化的足细胞后，Ang Ⅱ诱导的TRPC6过表达得到抑制。Wang等[22]发现TRPC6活化后介导Ca2+内流增强了足细胞NADPH氧化酶活性，而NADPH来源的ROS可上调TRPC6的表达。此外，Zhang等[23]的研究中显示，Ang Ⅱ处理足细胞后还可通过激活细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路致核因子κB(NF-κB)核转录而上调膜表面TRPC6表达。Ang Ⅱ活化TRPC6并增强TRPC6的核转录，故TRPC6放大了Ang Ⅱ对足细胞的损伤(图1)。

图1　Ang Ⅱ活化TRPC6并增强其核转录示意图

活化TRPC6介导足细胞足突融合

足细胞膜上信号通路调控足突融合越来越多证据显示，肾小球上皮细胞(足细胞)损伤是形成蛋白尿的一个最重要机制[25-27]。以大量蛋白尿为表现的肾小球疾病，包括FSGS[27]、微小病变(MCD)[28]和糖尿病肾病[29]，其中足细胞的损伤以足突融合为主要表现。基于这些特殊的细胞生物学特点，足细胞及裂孔隔膜对维持肾小球滤过屏障的完整性具有重要作用[30]。近年来足细胞膜分子的作用越来越受到重视，它们将细胞外信号传递到细胞内并影响细胞结构，尤其是足突结构。事实上，与感觉神经元相似，足细胞的细胞体和主突的功能可能仅仅是向足突提供营养。足细胞足突被功能性分为顶膜区、基膜区和裂孔隔膜区，这些区域细胞膜在结构和功能上与足突的肌动蛋白骨架紧密联系，这些细胞膜区域任何部位改变将影响肌动蛋白骨架，使其由平行可收缩的捆状排列变成杂乱无序的网状排列，肌动蛋白骨架的重排致足突融合。这一过程受很多信号分子的调控，不仅仅局限于整合素的活化、GPCR的和生长因子受体的活化的调控，还受Ca2+和内流信号通路的调控。体内研究证实，足突融合与蛋白尿的出现密切相关[31,32]，并可解释足细胞的损伤可出现大量尿蛋白。

活化TRPC6介导的Ca2+内流信号致足突细胞骨架重排Winn等[3]对TRPC6的研究发现，当Ang Ⅱ使活化TRPC6介导的Ca2+内流显著增加时，足细胞内细胞骨架的排列出现异常，可改变足细胞足突的收缩结构。Ca2+内流和细胞骨架主要调节分子RhoGTP酶活化之间存在紧密关系[33]，基于钙离子和肌动蛋白细胞骨架的重要作用，RhoGTP酶已成为目前很多足细胞研究的方向。在细胞水平，未受损的足突中RhoA活性占主导地位，而不稳定、可伸缩的足突中，Cdc42/Rac1活性占主导。最近研究显示，Synaptopodin是足细胞RhoGTP酶的重要调节因子，可抑制RhoGTP酶的泛素化和蛋白酶降解[34]，可通过促进RhoA而抑制Cdc42/Rac1，因此可预防足突细胞骨架的重排。而活化的TRPC6通过Ca2+内流活化钙调磷酸酶并促进Synaptopodin降解，故TRPC6可通过此途径使足细胞骨架重排、足突融合。Rac1促进盐皮质激素受体进入足细胞核内。Tian D研究显示，TRPC6敲除将导致应力纤维减少、Rac1活化、运动力增强，并可通过RhoA持续活化改善[13]。

活化TRPC6介导足细胞凋亡

Ang Ⅱ被认为是诱导足细胞凋亡的始动因素之一[35]，其诱导凋亡途径尚未明确，而通过TRPC6介导足细胞凋亡途径的研究则更为有限。Zhang H等体外实验证实，Ang Ⅱ可通过上调TRPC6，活化下游ERK及NF-κB的核移位，诱导足细胞凋亡[36]。Yang等[37]则在体外高糖环境下培养的小鼠足细胞研究中发现，高糖诱导ROS产生，ROS通过活化足细胞TRPC6介导Ca2+内流增加，并通过Ca2+内流激活RhoA/ROCK通路导致足细胞凋亡，敲除小鼠足细胞TRPC6基因，则足细胞凋亡明显受到抑制。Ang Ⅱ也通过其AT1R介导ROS的产生[1]，故有理由推测，Ang Ⅱ是否也可通过活化TRPC6通道介导Ca2+内流及RhoA/ROCK通路致足细胞凋亡，但国内外尚缺乏相关文献报道(图2)。

图2　TRPC6介导足细胞损伤、凋亡信号传递示意图

综上所述，通过对Ang Ⅱ诱导足细胞损伤的信号传导机制和TRPC6通道的研究，我们发现足细胞内AT1R活化、TRPC6通道、Ca2+信号通路、RhoGTP酶活化、足突细胞骨架的重排和足突融合之间的联系。因此，AT1R阻滞剂、TRPC6通道可能成为非常有价值的药物靶点。

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