长链非编码RNAs与妇科肿瘤

刘 璐，赵文钺，刘福囡

(1.中国医科大学，辽宁 沈阳 110001;2.中国医科大学第一附属医院肿瘤外科，辽宁 沈阳 110001)

1 长链非编码RNA

随着深度测序和去基因组高密度“覆瓦式”等高通量测序技术的快速发展，研究者发现人类基因组中有成千上万的RNA进行转录，其中只有1.5%具有编码蛋白质的功能，非编码RNAs(ncRNAs)的数量超过编码蛋白质基因数量的好多倍［1-3］。其中ncRNAs又分为微小 RNAs(22～23 nts，microRNAs)和长链非编码 RNAs(＞200 nts，lncRNAs)［4］。

目前，对lncRNA最常使用的定义是:长度大于200个核酸，且不翻译蛋白质的RNA。但这个定义过于简单，而且没有考虑到某些问题。首先，规定为200个核酸是被随意选择的，且多数是在RNA纯化期间RNA结合在硅胶柱上为基础定义的，而不是从其功能意义上解释的［5］。其次，一个PCG总是被定义为转录本，包含多于100个氨基酸的开放阅读框(opening reading frame，ORF)［6］。但是，lncRNAs可以包含长于100个氨基酸的ORFs，而且它们不一定合成多肽;另外，少于100个氨基酸的多肽在生物体中会发挥功能，它们并不是蛋白质的典型副产物［7］。最后，同样的RNA可以同时包含PCGs功能和非编码功能［8-10］。这些事实都表明目前人类对ncRNAs了解甚少，可见定义它非常困难。

因此，基于以上问题［11］，对 lncRNAs提出了新的定义:有原始或是剪切转录本功能的RNA，并不符合miRNAs、piRNAs和snoRNAs等小分子RNAs的已知定义，或是不属于结构RNAs的范畴(例如，转移 RNA、核仁小分子 RNAs和剪切RNA)。这种定义的优势就在于缺乏ORFs限制的情况下，指出RNA分子既可以具有编码功能，也可以具有非编码功能，而且可以在随意的位置存在长度缺失。

大多数的RNA转录本除了为蛋白质的合成提供模版外，还执行着许多不同的功能，如:控制胚胎发育、分化、印记、X染色体失活、免疫反应、应激反应。这些RNAs中有很大一部分像lncRNAs一样，作为信号分子，导航系统和核苷酸复合物装配平台而存在，它们参与了RNA的转录调控、剪接、编辑、交通、翻译和降解等过程［12］，在转录水平和转录后水平上调节基因的表达［13］，而且在基因表达中起到不同的作用［14］。

2 lncRNAs与妇科肿瘤

2.1 lncRNAs与宫颈癌

哺乳动物的基因间长链非编码RNAs(lincRNAs)因调节转录过程而为人所知。lincRNA-p21作为翻译调节器参与了转录后进程。在降低RNA结合蛋白HuR的水平时，lincRNA-p21在人类宫颈癌 HeLa细胞中累积，使它和转录因子JunB、编码β-连环索基因CTNNB1的mRNAs的关系增强，并选择性地使它们的翻译降低。而随着HuR的升高，数量下降的 lincRNA-p21抑制了JunB和与细胞分裂有关的β-连环索的翻译。可见HuR通过影响lincRNA-p21的水平来控制mRNAs靶点的翻译。这表明lincRNA具有转录后抑制的功能［15］。

胰岛素样生长因子2(IGF2)在父源等位基因表达，而H19在母源等位基因表达［16］。IGF2和H19的表达水平会在失印迹宫颈癌中改变。和正常组织相比，检测了32例宫颈癌中的印迹状态。IGF2的失印迹状态(LOI)在18例中存在7例(39%)。H19基因的 LOI在14例中存在5例(36%)。与正常组织相比，在LOI肿瘤中IGF2出现水平增长现象，H19出现水平下降现象，而两者在印迹状态(MOI)肿瘤中没有表现出明显的变化。这些结果表明IGF2和H19表达水平的改变可能与表达IGF2双基因的宫颈癌发展有关［17］。

GAS5是一个以lncRNA形式存在的多种剪切异构体，包含12个外显子。在宫颈癌细胞中GAS5的过量表达影响着细胞生存和代谢。其可发挥诱导转录的功能，防止糖皮质受体结合到靶基因上［18］。

人肺腺癌转移相关转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript，MALAT)是一种基因间长链非编码RNA，最初在非小细胞肺癌中被发现，被认为与非小细胞肺癌转移有关［19］。Tano等［20］研究发现MALAT1表达与肿瘤细胞侵袭能力有关，采用针对MALAT1短发卡结构的RNA抑制剂可使人宫颈癌细胞增殖和侵袭能力显著下降。

Qin R1等［21］运用实时qRT-PCR技术研究了MEG3在18对宫颈癌细胞和癌旁组织中的表达，结果表明MEG3在非肿瘤组织中高度表达，但是在癌症组织中明显减少，而且MEG3的异位表达会抑制人类宫颈癌细胞HeLa和C33A在体外增殖，敲除MEG3可以促进分化良好的宫颈癌细胞HDD94的增殖。MEG3的过量表达会造成G2/M细胞周期停滞并诱导细胞凋亡。

2.2 lncRNAs与卵巢癌

应激诱导长非编码转录本5(long stress-induced noncoding transcript 5，LSINCT5)是一个长2.6 kb，多聚核苷酸化的、负链的长链应激非编码转录本，位于细胞核内，由RNA聚合酶III转录。相比于正常组织，LSINCT5在乳腺癌、卵巢癌细胞系中会过量表达。此外，敲除癌细胞系中的LSINCT5会导致细胞增殖水平的下降。最后，通过使用Affymetrix U133 Plus 2序列敲除LSINCT5之后发现了改变超过2倍的95个基因，选择了一些基因用qPCR验证，发现10个基因受LSINCT5的敲除的影响。其中，显著下调的2个基因是核副斑点包装转录本1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT-1)和蛋白质编码基因PSPC1(paraspeckle component 1)［22］。

X失活特异性转录本(X-inactive specific transcript，XIST)RNA和女性细胞中的X染色体沉默有关，使其和男性的X染色体达到平衡［23］。XIST通常在女性体细胞中表达，但是人们发现XIST在乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌细胞系中失表达［24-25］。Benoit等探究了X染色体基因表达，并对卵巢癌细胞系中的Barr小体进行了染色。他们发现和正常卵巢上皮细胞相比，有一半的癌症细胞系中检测不到XIST，而且在这些细胞系中观测到了Barr小体的缺失［25］。其他调查者发现，在 XIST表达水平下降的卵巢癌细胞系中，通过紫杉醇治疗后的细胞，其灵敏度下降，这表明在人类卵巢癌细胞中XIST可以作为化疗反应性的预后标志物［23］。

卵巢癌腹水(ovarian cancer with ascites，OCAF)在女性晚期疾病阶段经常出现，其中存在大量恶性肿瘤细胞，目前还没有有效的治疗方法。Mizrahi A等运用原位杂交技术(in situ hybridization，ISH)在90%存在OCAF的患者中检测出了H19 RNA。H19在正常组织中几乎检测不到，只有在人类癌组织中才高水平表达。将DTA-H19注射到异位发展的肿瘤中会引起40%肿瘤生长抑制［26］。

印迹胰岛素样生长因子II(insulin-like growth factor2，IGF2)的过量表达是妇科恶性肿瘤的一个突出特征。Murphy SK等发现IGF2的上调和H19近段印迹中心的CCCTC转录因子结合位点1和6的甲基化有密切联系(分别是P=0.05和P=0.02)。跟从未患有恶性肿瘤妇女中提取出的淋巴细胞DNA相比，癌症DNA中的CCCTC转录因子结合位点1和6的甲基化现象会频繁地出现(位点1和位点6都是P＜0.0001)。而且跟正常淋巴细胞DNA(P=0.004)相比，卵巢癌也更容易表现出印迹IGF2启动子上游的母源性特定等位基因的甲基化［27］。Miura K 等［28］也发现 H19 和SNRPN的甲基化程度增强是肿瘤细胞发生的开始，而且和卵巢畸形瘤有着密切的关系。

Qiu JJ等［29］的研究表明HOTAIR在卵巢癌上皮(EOC)组织中表达升高，它与FIGO分期、肿瘤的组织学分型、淋巴结转移高度相关，并且减少了总生存期(OS)和无病生存率(DFS)，可以作为患者OS和DFS的独立影响因素。另外，体外试验的研究结果表明在高转移卵巢癌细胞株中(SKOV3.ip1、HO8910-PM 和 HEY-A8)HOTAIR 的表达抑制会明显降低细胞的转移和侵袭，体内实验进一步证明了HOTAIR对转移的影响，它的转移作用一部分是通过调节金属蛋白酶和上皮间质转化相关基因而被介导的。

此外，Liu SP等［30］的研究结果表明 lncRNAs在具有不同转移能力的卵巢癌细胞中的表达不同。和SKOV3细胞相比，SKOV3.ip1在体外的侵袭活性明显增强。在对4956 lncRNAs进行微阵列检测后发现，在SKOV3细胞中583lncRNAs上调，在SKOV3.ip1细胞中578lncRNAs下调，有7种 lncRNAs失控，其中包括:MALAT1、H19、UCA1、CCAT1、LOC645249、LOC100128881 和LOC100292680。

2.3 lncRNAs与子宫内膜癌

Tanos V等［31］运用非放射性原位杂交技术分别探测了H19和IGF2在正常子宫内膜，增生的子宫内膜和子宫内膜癌中的表达。H19在正常子宫内膜上皮不表达，但是在增生的子宫内膜上皮和子宫内膜癌中的表达分别达到了15%和60%。而在基底层细胞，H19在正常情况，增生情况和癌症中的表达分别是75%、55%和37%。根据子宫内膜癌细胞的分化程度，上皮细胞中的H19的表达随着组织分化程度的降低而升高。研究结果表明H19在子宫内膜增生和子宫内膜癌上皮细胞的表达水平值得进一步研究，而且可以用H19作为辅助性的预后标志物或是用于辅助病理学诊断。此外，经Kaplan Meier统计分析，MALAT1可作为一级子宫内膜间质肉瘤的诊断标准［28］。

2.4 lncRNAs与乳腺癌

一个2.2 kb长的lncRNA、HOTAIR，位于同源异形盒基因(homeobox，HOX)位点内，它是一种典型的反义lncRNA，表达自HOX基因的反义链。HOTAIR，在临床乳腺癌中显著地过量表达，而且HOTAIR在原发性乳腺癌与转移性乳腺癌中的表达水平有明显的差异，因此可以作为预测乳腺癌转移的良好标志物［32］。有研究指出，降低细胞内HOTAIR的表达水平能够抑制乳腺癌细胞增长，特别是抑制多聚发夹复合体2(PRC2)过度活跃的癌细胞的侵袭能力［4］。除此之外，通过抑制HOTAIR和LSD1的相互作用也可以限制乳腺癌细胞的转移潜力［33］。这也使HOTAIR成为乳腺癌诊断和预后判断的一个重要标志物［4］。

研究者发现生长抑制特异性5(GAS5)在临床乳腺癌组织中下调，而且在MCF-7乳腺癌细胞系中这种lncRNA的过量表达会抑制细胞的生长，并且加快细胞凋亡［34］。GAS5在缺少营养物质或生长因子的生长抑制细胞中被诱导，并且它和糖皮质激素反应元件(GREs)竞争糖皮质激素受体(GR)的结合点，从而通过GR来阻止转录激活，反过来，导致细胞代谢功能降低［18，35］。因此，在细胞饥饿的状态下，GAS5在癌症中的下调可能有助于维持细胞活性和生长活性。

H19是在IGF2沉默的母源等位基因中表达的印记基因。H19在许多实体瘤中异常表达，而在周围正常组织中几乎找不到［36］，大多数乳腺癌高水平地表达H19。H19通常在基质细胞中过量表达，在肿瘤上皮细胞中表达很少，而且与雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的存在有关［37］。H19在不同癌症中表现出的作用不同，有原癌或是抑癌作用［38］。在乳腺癌细胞系中，H19 RNA的表达直接被E2F1所调控并且有促进细胞周期进程的作用［39］。

另外，大规模基因组研究也表明，SRA、MEG3、BC200、XIST、MALAT-1、BC1 等 lncRNAs在乳腺癌与正常乳腺组织中的表达存在统计学上的差异。尽管这些lncRNAs在乳腺癌中的作用机制尚不清楚，但是可以通过检测其表达量来预测癌症的发生。

3 问题与展望

尽管人们越来越认识到长链非编码RNAs在人类正常生理和疾病中的重要性，但对肿瘤相关性lncRNAs的认识还很有限［40］。妇科肿瘤已经成为对女性最具危害性的杀手之一，而且越来越趋向于年轻化，尽早采取治疗措施已迫在眉睫。

虽然许多研究者已经发现多种lncRNAs在妇科肿瘤中异常表达，但是它在肿瘤中的作用机制依然有待于进一步研究。随着研究的深入，lncRNAs很可能会在未来为妇科肿瘤的早期诊断、发生发展、侵袭以及预后过程中做出巨大贡献。

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