高效液相色谱法测定一次性使用真空采血管中的EDTA-Na2
2014-03-21秦黎尹菁
秦黎 尹菁
1 江苏省医疗器械检验所 （南京 210033）
2 江苏省食品药品检验所 （南京 210008）
0.引言
乙二胺四乙酸(EDTA)盐作为一次性使用真空采血管中的抗凝剂在临床上应用广泛。由于EDTA 对血细胞形态影响很小，因此适用于血细胞计数，特别是血小板计数。常用的EDTA 有二钠、二钾和三钾盐。乙二胺四乙酸二钠盐与氟化钠混合添加的采血管还可用于血糖检测。抗凝需要足够量的EDTA，但过量的EDTA 会改变血细胞形态学，因而有必要控制真空采血管中EDTA 盐的含量。[1]
目前常用的EDTA 检测方法有渗透压法[2]和滴定法，这两种方法的专属性较差，不能区分EDTA 与其他金属络合剂，尤其在有氟化钠存在时可能对检测有影响；灵敏度较低，对于公称容量较小，EDTA 含量较低的样品，在测定中可能存在较大误差。通过比较参考文献中的几种色谱条件[3][4][5]，本文建立了一种专属性强，灵敏度高，且准确方便的高效液相色谱测定方法。
1.仪器与试药
岛津20AB 高效液相色谱仪（日本）；BT125D电子天平（德国Sartorius）；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯乙二胺四乙酸二钠二水合物（国药集团化学试剂有限公司，纯度≥99.0%，批号：T20090303）
一次性使用真空采血管均由苏州鱼跃医疗科技有限公司提供，样品1（含EDTA-Na2,批号：130402，公称容量为2ml，每毫升血液中含EDTA1.4mg～2.0mg），样品2（含EDTA-Na2/氟化钠,批号：130403，公称容量为2ml，每毫升血液中含EDTA1.2mg～2.0mg；氟化钠2mg～4mg）
2.色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相为甲醇-25%四丁基氢氧化铵-88%甲酸-水(20:1.3:0.6:980)（pH3.5）；检测波长：254nm；柱温：30˚C; 流速: 0.6 mL/min; 进样量：20 μl。
供试品溶液：取一次性使用真空采血管一支，用少量水洗涤数次，将内含的添加剂定量转移至20ml 量瓶，用水定容，摇匀，精密量取5ml至50ml 量瓶，精密加0.1mol/L 的三氯化铁溶液1ml，用水定容，摇匀（乙二胺四乙酸二钠浓度约为20μg/ml）。
该色谱条件下，乙二胺四乙酸铁络合物峰的理论板数为15000 左右，与相邻峰的分离度良好，见图1。
图1. 高效液相色谱图
3.方法学考察
3.1 线性范围与定量限
精密称取乙二胺四乙酸二钠二水合物约100mg，加水溶解，并定容至100ml，摇匀，作为对照品储备液，分别精密量取5ml、4ml、3ml、2ml、1ml、0.5ml、0.2ml 至50ml 量 瓶，各 精 密加0.1mol/L 的三氯化铁溶液1ml，用水定容，摇匀，作为线性范围供试液。结果表明乙二胺四乙酸二钠在4μg～100μg/ml 浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=1.0000）。
将对照品储备液逐级稀释后，精密量取适量至50ml 量瓶，同法操作，得到S/N 为10 时，定量限为0.04μg/ml
3.2 精密度试验
取样品2 供试品溶液，连续进样6 次，RSD为0.1%，表明进样精密度良好。取同一批供试品，按上述方法配制供试液共6 份，含量测定结果的平均值为1.85mg/ml，RSD 为1.5%（n=6）,表明本方法重复性良好。
3.3 回收率试验
精密量取乙二胺四乙酸二钠对照品储备液适量，按含量测定结果的80%，100%，120%，按处方量添加同样浓度梯度的氟化钠作为空白背景，每个浓度测定3 份样品，计算回收率，结果3 种浓度的平均回收率为97.4%
3.4 稳定性试验
取样品2 供试品溶液，分别在0,1,2,4,8 小时进样，测定乙二胺四乙酸二钠含量，计算峰面积的变化程度。结果RSD 为0.7%，表明乙二胺四乙酸二钠溶液在室温条件下8 小时内稳定。
4.含量测定
按上述方法检测样品1，样品2 两个品种的一次性使用真空采血管，乙二胺四乙酸二钠二水合物的含量分别为1.64mg/ml，1.87mg/ml。
5.讨论
由于乙二胺四乙酸二钠盐在酸性条件下能与多种金属离子螯合，选择了CuCl2和FeCl3分别加入对照品溶液进行络合反应，结果显示CuCl2与EDTA 生成的络合物峰形不如EDTA 与Fe 的络合物好，响应值也较低。
试验中比较了流动相pH 分别为3.5，5.0 和6.0时的色谱行为，结果显示pH 为3.5 时，色谱峰峰形最好，且溶液的稳定性也最佳。
试验中同时用该方法测定了含EDTA 二钾和三钾盐的一次性真空采血管，均能获得较好的峰形和结果，同样没有相邻杂质峰干扰。
[1] 朱虎定，孙小燕. 含添加剂真空采血管对生化结果的影响分析[J]. 基层医学论坛，2012,16（16）2133-2134.
[2] 骆红宇，孙光宇. 渗透压法测定一次性使用真空采血管中EDTA-K2 含量[J]. 生物医学工程研究，2006，第3 期，182-183.
[3] 刁志忠，韩继永，陈祥峰.HPLC 法测定注射用泮托拉唑钠中乙二胺四乙酸二钠的含量[J]. 药物分析杂志，2011，31（2）：282-284.
[4] 耿志旺，刘蔚，刘茜，等.HPLC 法测定丙泊酚注射液中乙二胺四乙酸二钠含量[J]. 药物分析杂志，2011，31（3）：586-588.
[5] 卢京光，裴琳，周景岳，等.反相离子对色谱法测定硫普罗宁注射液中乙二胺四醋酸盐的含量[J]. 药物分析杂志，2011，31（4）：772-775.
