我国邓恩桉组织培养研究进展

邓紫宇，陈健波，周 维

(广西林业科学研究院 国家林业局中南速生材繁育实验室 广西优良用材林资源培育重点实验室，广西 南宁 530002)

我国邓恩桉组织培养研究进展

邓紫宇，陈健波，周 维

(广西林业科学研究院 国家林业局中南速生材繁育实验室 广西优良用材林资源培育重点实验室，广西 南宁 530002)

邓恩桉是优良的耐寒树种。本文论述了我国邓恩桉组织培养研究概况，从外植体的选取与消毒、培养基的选择、培养条件和瓶苗的移栽等方面分别进行阐述，同时针对邓恩桉组织培养过程中存在的问题提出了意见和建议，为今后邓恩桉工厂化育苗提供参考。

邓恩桉；组织培养；研究进展

邓恩桉(Eucalyptus dunnii)属桃金娘科(Myrtaceae)桉树属(Eucalyptus spp.)，具有干形通直、病虫害少且耐寒性强等优良特性，成为国内外热点研究树种。邓恩桉原产于澳大利亚，有性繁殖困难且种子进口费用昂贵，组培快繁体系的建立成为国内外热点研究方向，但尚未见规模化生产。本文针对国内邓恩桉组织培养的研究，从外植体的选取与消毒、培养基的选择、培养条件和瓶苗的移栽等方面进行归纳总结。

1 外植体的选取与消毒

外植体的选取与消毒是组织培养的第一步，木质化程度决定外植体的褐化率，消毒时间决定外植体的污染率。邓恩桉组织培养外植体主要选取半木质化带芽茎段，消毒一般采用70%乙醇和0.1%升汞配合一次性灭菌。王以红等[1]认为 0.15%升汞处理邓恩桉种子效果较好。

2 培养基的选择

2.1 基本培养基

培养基是离体材料生存的物质基础，正确选择培养基是组织培养成功的关键。一般情况下培养基由六类物质组成，包括大量元素、微量元素、维生素、有机附加物、生长调节物质和碳源。根据试验培养的目的，邓恩桉常用培养基包括MS、改良MS、B1、B5、改良B5、N6、F、H、改良H、White。

2.2 诱导培养

外植体诱导培养是植物组织培养的前提，生长调节物质的平衡是外植体诱导培养的关键。外植体诱导培养受季节和温度的影响，一般情况下，诱导最佳季节为春秋两季。欧阳磊等[2-3]研究表明邓恩桉诱导培养最适培养基为1/2 MS + BA 0.5 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1，认为试验材料本身基因型的差异决定其是否适合离体培养，在蔗糖、大量元素及有机物三因素研究中蔗糖对邓恩桉芽的生长起主导作用。陈研华等[4]认为MS + 6-BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1培养基为邓恩桉最佳诱导培养基。林彦等[5-6]研究表明MS + 6-BA 0.5 mg·L-1培养基最适合邓恩桉诱导培养，诱导率达到 73%，6-BA浓度影响邓恩桉平均芽高，且成负相关关系。易敏等[7]认为MS + 6-BA 0.2 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1培养基诱导外植体芽的分化效果最佳，在不同生长素对邓恩桉芽诱导的试验中，NAA的诱导效果大于IBA和IAA；在不同细胞分裂素对邓恩桉芽诱导的试验中，6-BA诱导的丛生芽与增殖倍数显著大于KIN，在不同激素组合对邓恩桉芽诱导的试验中，NAA的诱导效率高于IBA。王以红等[8-9]研究显示邓恩桉下胚轴最佳诱导培养基为改良MS + BA 0.5、1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1，诱导率40% ~ 50%，BA不能诱导邓恩桉子叶产生不定芽基，但能诱导邓恩桉下胚轴不定芽原基的形成；邓恩桉萌芽条茎段最佳诱导培养基为改良B5+ 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1，120 d时80%出现丛生芽且生长健壮。黄绿荷等[10-11]认为诱导培养邓恩桉以MS + 6-BA 2.0 mg·L-1+ NAA 0.12 mg·L-1最佳，诱导率可达 66%，顶芽诱导率高于中下段。宋建英[12-14]认为邓恩桉种子与茎段在 MS + KT 1.0 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1培养基上芽的诱导分化能力强，有效芽比率高，MS可作为邓恩桉芽诱导首选培养基。翁秋媛[15]认为培养基改良MS + 6-BA 0.6 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1是邓恩桉芽诱导的最适培养基。陆素君等[16]试验结果表明改良MS + BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.25 mg·L-1培养基适合邓恩桉茎段进行组织培养。管朝旭等[17]认为采用F + 6-BA 0.5 mg·L-1+ IBA 0.3 mg·L-1培养基有利于邓恩桉的不定芽诱导。

从文献上看，国内大部分研究者采用MS + 6-BA + NAA组合进行邓恩桉组织培养芽的诱导，主要差异在于分裂素与细胞分裂素的浓度不同，这可能与试验条件及参试材料本身基因型的差异有关。不同激素组合对邓恩桉芽的诱导要好于添加单一激素诱导和不添加激素诱导。

2.3 增殖培养

增殖培养是组织培养的中心环节，增殖系数决定组织培养的效率。陈研华等[4]试验筛选出适合邓恩桉增殖的培养基为改良MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.3 mg·L-1，增殖倍数达到3.26。王以红等[1,8]认为改良MS + BA 0.2 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1培养基可进行邓恩桉下胚轴增殖培养，增殖倍数3倍；改良B5+ 6-BA 0.18 mg·L-1+ NAA 0.14 mg·L-1培养基有利于邓恩桉茎段不定芽的增殖和生长，增殖系数3倍，同时认为在增殖培养基中添加200 mg·L-1的CH，可以有效控制叶片泛黄。马英等[18]利用MS、改良MS和1/2 MS 3种培养基进行邓恩桉增殖培养对比试验，结果显示改良MS优于其他两种培养基，更适合邓恩桉增殖培养，BA浓度和NAA浓度随继代培养次数的增加而减少，继代5 ~ 6次后稳定在一定范围，最初几次继代培养的培养基为改良MS + BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1，继代5 ~ 6次后的增殖培养基为改良MS + BA (0.1 ~ 0.3) mg·L-1+ NAA (0.05 ~ 0.1) mg·L-1。易霭琴等[19]研究显示适合邓恩桉继代增殖培养的条件为改良H + IBA 0.2 mg·L-1+ BA (0.2 ~ 0.4) mg·L-1+ NAA (0.1 ~ 0.2) mg·L-1，增殖系数达到4.932，认为在培养基中添加20 mg·L-1谷氨酸能够增强植株的光合生理功能，有效促进邓恩桉的生长，平均苗高达到6.237 cm，试管苗的平均苗高随着谷氨酸的浓度增加而增高。林彦等[5-6]的研究表明MS + 6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1培养基繁殖率大，但叶呈浅黄绿色，而MS + 6-BA 0.3 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1培养基叶呈绿色，但芽容易伸长细化，认为两种培养基交替使用可用于邓恩桉的继代培养。宋建英[12-14]认为邓恩桉实生苗继代培养较为理想的培养基配方为H + BA 2.0 mg·L-1+ IAA 0.2 mg·L-1，邓恩桉茎段继代培养较为理想的培养基配方为改良MS + KT 0.8 mg·L-1+ NAA 1.0 mg·L-1，增殖系数可达4.25，KT显著影响邓恩桉芽增殖系数。翁秋媛[15]试验结果显示最优邓恩桉继代增殖培养基为改良MS + 6-BA 0.6 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1，增殖系数高达 4.76。赵晓军[20]认为邓恩桉继代增殖培养基为Eu + 6-BA 3 mg·L-1+ NAA 0.3 mg·L-1，激素的含量随着继代培养次数的增加而降低，但一般情况下细胞分裂素的浓度不得少于 2 mg·L-1，当继代培养达到10次后，邓恩桉的增殖系数在不使用激素的情况下仍能保持较高水平。燕丽萍等[21]研究表明邓恩桉增殖培养最佳组合为改良WPM + KT 0.5 mg·L-1+ TDZ 0.2 mg·L-1+ NAA 0.01 mg·L-1。陆素君等[16]实验结果表明邓恩桉继代增殖培养选用改良MS + BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.25 mg·L-1和改良MS + BA 0.2 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1交替使用效果理想。管朝旭等[17]认为邓恩桉初期继代增殖采用F + 6-BA 0.5 mg·L-1+ IBA 0.3 mg·L-1培养基，增殖系数达到3.68，邓恩桉中后期继代增殖采用F + 6-BA 0.25 mg·L-1+ IBA (0.25 ~ 0.5) mg·L-1培养基，增殖系数达到3.26。

从文献上看，各研究者采用的增殖培养基和激素配比不尽相同，但增殖系数基本在3倍以上，增殖效果较为理想，这与桉树自身基因型有关。

2.4 生根培养

邓恩桉组培生根是个难点，受多方面因素影响。欧阳磊[3,22]研究表明采用两步生根法基本解决邓恩桉组培生根难的问题，首先在 MS + IBA 3 mg·L-1培养基上暗培养9 d，然后转入不添加任何激素的培养基上光培养。在基本培养基对邓恩桉生根的影响研究中，MS培养基生根率最高；在蔗糖、大量元素和有机物对邓恩桉生根的影响研究中，蔗糖对邓恩桉组培苗生根的影响最大，其次是大量元素，有机物对邓恩桉组培苗生根的影响最小；在激素选择和配比对邓恩桉生根的影响研究中，添加IBA的培养基生根率高于添加ABT和NAA的培养基，且不易形成愈伤组织。陈研华等[4]认为邓恩桉最适生根培养基为B2+ ABT1号生根粉0.8 mg·L-1。易敏等[7]认为1/2 MS + IBA 0.2 mg·L-1培养基生根效果较好，能形成2 ~ 3条根。王以红等[8-9]研究显示1/2改良MS + IBA 1.0 mg·L-1+ NAA 1.7 mg·L-1培养基能够诱导以邓恩桉下胚轴为外植体的单芽产生不定根，生根率为70%，1/2 B5+ IBA 1.2 mg·L-1+ NAA 1.6 mg·L-1培养基能够诱导以邓恩桉茎段为外植体的单芽产生不定根，生根率为73.3%。林彦等[5-6]研究表明MS + IBA 0.5 mg·L-1培养基可用于邓恩桉的生根培养，在蔗糖、大量元素、微量元素和有机物对邓恩桉生根的影响研究中，大量元素对邓恩桉组培的影响最大，其次是微量元素，蔗糖对邓恩桉组培生根影响最小，该研究结果与欧阳磊[3,22]的试验结果存在差异，可能与试验环境因素有关。朱鹏等[23-24]研究邓恩桉生根抑制物，在MS + 6-BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.2 mg·L-1培养基上诱导邓恩桉，在 MS + 6-BA 0.08 mg·L-1+ NAA (0.12 ~ 0.14) mg·L-1培养基上进行邓恩桉增殖培养，在1/4 MS培养基上进行邓恩桉生根培养，结果显示邓恩桉在各配比培养基上生根率都很低甚至不生根；在对邓恩桉组织体内生根抑制物的研究中，邓恩桉组织材料提取液对受试材料基本都呈现不同程度的抑制作用。宋建英[12-14]试验结果表明ABT和IBA不同浓度的组合比单独使用ABT或IBA对邓恩桉组培苗生根效果要好，1/2 MS + ABT 1.0 mg·L-1+ IBA 0.01 mg·L-1培养基和1/2 MS + ABT 1.0 mg·L-1+ IBA 0.01 mg·L-1培养基都是邓恩桉生根的优化培养基。翁秋媛[15]通过筛选生长素与细胞分裂素等措施优化邓恩桉组培生根培养基，确定优化生根培养基为改良MS + IBA 0.5 mg·L-1+ 6-BA 0.05 mg·L-1，该培养基能够有效地抑制愈伤组织的形成，提高生根率。燕丽萍等[21]在不同生长素与激素组合对邓恩桉生根影响的研究中指出最适合邓恩桉组培生根的培养基为改良1/2 MS + IBA 3.0 mg·L-1+ NAA 0.01 mg·L-1+ KT 0.05 mg·L-1，邓恩桉不定根可以直接产生也可以通过脱分化再分化途径产生。陆素君等[16]利用改良MS + IBA 0.5 mg·L-1+ ABT 2.5 mg·L-1培养基和改良MS + IBA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1培养基对邓恩桉单芽进行生根诱导，结果显示，两种激素组合对邓恩桉组培生根效果不佳，基本为1条根且生根率仅为20%。管朝旭等[17]认为改良1/3 MS + ABT 1号生根粉1.0 mg·L-1培养基适合邓恩桉组培生根，生根诱导率达到84.67%且根系生长良好。

邓恩桉组培生根是学者们研究的热点与重点，在对大量元素、微量元素、有机物、蔗糖、激素和光照等因素进行综合研究分析后，各学者都建立了各自的最适邓恩桉组培生根体系，且生根率理想，但是各体系试验的重复性较差，邓恩桉组培生根难的问题仍存在，需要进一步优化研究。

3 培养条件

桉树组织培养研究成果丰厚，很多优良无性系已见工厂化育苗，桉树组织培养技术稳定，培养条件相似。从文献上看，各研究者在进行邓恩桉组织培养中采用的培养条件大致相同。培养温度(25 ± 3)℃、光强1 000 ~ 4 000 lux、pH值5.8 ~ 6.5是常用的桉树组织培养的培养条件[25]。易霭琴等[19]研究了邓恩桉继代增殖培养条件，认为邓恩桉增殖系数随pH值升高而上升，达到6.2后，随pH值的升高而下降，pH值在6.0~ 6.2时有利于邓恩桉继代增殖；光强太弱不利于邓恩桉的增殖和苗高生长，光强太强抑制光合作用，苗高降低，2 500 lux的光强最有利于邓恩桉继代增殖。马英等[18]认为较强的自然光照是邓恩桉继代增殖培养苗生长的必需条件。暗培养能够有效地抑制酚类化合物的氧化，因此，在各培养阶段中，先进行一段时间的暗培养再进行光培养更有利于邓恩桉开展后续的工作。

4 瓶苗的移栽

瓶苗的移栽是组织培养的最后一步，基质的选择关系到苗的成活率。瓶苗从无菌状态移栽到自然环境容易感染，为了提高移栽成活率必须创造适合瓶苗生存的特殊环境。陈研华等[4]研究显示红心土育苗根系不发达，轻型基质育苗根系发达但成本高，长远角度考虑红心土最适合作邓恩桉瓶苗移栽基质。宋建英[12-14]认为轻型基质有利于邓恩桉根系的发生，有利于邓恩桉吸收水分，能够提高邓恩桉组培苗的移栽成活率且上山造林方便。燕丽萍等[21]在装有细沙：土：育苗基质=4:1:1的育苗盘中过度移栽到大田的成活率高达93.8%。育苗基质主要考虑吸水性和营养物质，吸水性强则能够防止根部水分过多而烂根，营养物质则能够满足苗的正常生长。

5 问题及建议

邓恩桉组织培养研究虽然取得了一定的进展，组培体系也建立了不少，还申请了一些专利，但是这些组培体系试验重复性不高，无法满足工厂化育苗的需求，还需要更深入的研究。

邓恩桉组织培养中主要存在以下问题：污染、褐化、玻璃化以及遗传变异。污染是困扰桉树组培的一个主要问题，主要体现在消毒阶段，要避免污染应严格按照试验章程认真做好每一步消毒工作。褐化是由外植体自身生理活性引起的，要避免褐化应合理消毒时间、小心操作，在培养基中添加核黄素可有效地降低褐化率。玻璃化也是组培常遇到的问题，是由培养条件或培养基不适合引起的，要避免玻璃化应优化培养条件和培养基。遗传变异是个复杂的过程，培养基是引起遗传变异的主要因素，因此要优化培养基以防止遗传变异[26-30]。

邓恩桉组织培养过程中最困难的步骤是生根培养，邓恩桉自身基因型决定其繁殖困难，要解决这一难题不仅要从组织培养各因素入手，还应从分子水平入手，从分子水平探讨邓恩桉生根困难的原因，为今后邓恩桉工厂化育苗奠定基础。

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Research Progress on Tissue Culture of Eucalyptus dunnii in China

DENG Zi-yu, CHEN Jian-bo, ZHOU Wei
(Guangxi Forestry Research Institute, Key Laboratory of Central South Fast-growing Timber Cultivation of Forestry M inistry of China Nanning, Guangxi Key Laboratory of Superior Timber Trees Resource Cultivation,Nanning 530002, Guangxi, China)

Eucalyptus dunnii is a superior cold-tolerant eucalypt plantation species. In this paper the tissue culture research situation of E. dunnii in China were discussed and reviewed, covering selection of explants and disinfection, culture media, culture conditions and transplanting of plantlets. Furthermore, some questions existing in the course of tissue culture E. dunnii were identified and discussed, providing references for future commercial production of tissue culture E. dunnii seedlings.

Eucalyptus dunnii; tissue culture; research progress

S722.3

A

2014-05-26

广西优良用材林资源培育重点实验室自主课题“邓恩桉遗传多样性的AFLP分析”(13A0102)

邓紫宇(1984— )，男，硕士，助理工程师，主要从事桉树遗传育种研究