肠道微生物群组与肠道免疫的关系

陈小林，任宏宇

华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科，湖北武汉430022

肠道微生物群由1 013 ～1 014 种微生物组成，其数量是人类基因组基因数量的一百倍之多。在不同个体间和同一个体一生中，其组成具有特异性。许多因素会影响肠道菌群的组成，比如生活方式［1］、遗传、不同地区、饮食、年龄等［2］。胃肠道既包含共生无害的细菌，也有潜在性病原菌［3］，它们共存于复杂的环境中。研究正常胃肠道内源菌的组成，有助于认识微生物如何影响免疫反应、饮食营养及代谢。多项数据表明肠道微生物群能调节肠道免疫系统的形成与成熟，抵抗病原菌入侵［4］。尤其是在生活早期，微生物群诱导肠道免疫系统识别无害与有害细菌，建立两者间的平衡，维护肠道健康。当这种平衡改变时，多种胃肠及肠外疾病就会发生。

1 肠道微生物与肠道黏膜

肠道菌群有保护、改善营养代谢及免疫的功能。共生菌能影响肠道黏膜免疫的发展，防止外源病原体入侵。无菌和常规动物的对比研究表明肠道菌群对黏膜免疫系统的形成和功能是必须的，尤其是在早期生活中［1］。已证实肠道免疫超微结构的形成依赖于肠道菌群。例如，无菌小鼠的绒毛毛细血管在婴儿期发育差，直到成年，仍然发育不良，说明微生物有助于绒毛中心血管生成［5-6］。与常规条件动物相比，无菌动物的肠黏膜相关淋巴组织和抗体产生不足，表现为细胞淋巴样滤泡、细胞固有层和肠系膜淋巴结原始中心的浆细胞减少［7-8］。微生物群同样有助于肠上皮内淋巴细胞的发育。

2 肠道微生物和天然免疫系统

黏膜天然免疫系统和微生物群之间的相互作用有利于肠道生态系统的免疫调节。天然免疫的一个典型特征即通过受体识别模式(PRR)来识别潜在的病原菌和无害抗原。Toll 样受体(TLRs)是主要的一类PRRs，表达于巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、肠上皮细胞和其他免疫细胞。TLRs 能使哺乳动物细胞识别微生物表面具有保守特征的分子，这被称为病原相关分子模式(PAMPs)。TLR2 能与TLR1 或TLR6 形成二聚体识别细菌细胞壁脂蛋白，TLR4 在CD14 和MD2 辅助下可识别革兰氏阴性细菌产生的脂多糖(LPS)，TLR5 表达于肠上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)的基底膜，能识别鞭毛蛋白，激活胞内信号NF-κB、诱生黏附分子和炎性细胞因子。而TLR9 识别未甲基化细菌DNACpG 基序，产生Th1 型细胞因子，促进NK 细胞胞毒活性。TLR2、4 和5 通常表达于细胞膜，而TLR9 表达于胞内。据报道，在IEC，TLR9 也能表达于细胞膜［9］。在正常条件下，IEC 低表达TLR2和TLR4，因此不会对TLR 刺激产生应答。但在炎症情况下，上皮内TLR 表达增加，这有助于炎症反应和免疫耐受［9］。TLR2 和TLR4 表达增加还与炎症性肠病有关［10］，而黏膜顶端TLR9 刺激有利于肠道稳态。体外培养系统显示IEC TLR4 和基底TLR9 的活性对启动炎症反应很重要，而顶端TLR9 激活支持抗炎反应的分化［11］。

肠上皮细胞是黏膜表面天然防御机制中最重要的部分。除了吸收、消化和分泌功能，还直接参与各种免疫过程。例如其通过免疫球蛋白与其聚合体的受体结合，将固有层浆细胞产生的分泌型免疫球蛋白运输到肠腔［12］。证据表明肠上皮细胞也能呈递抗原，肠上皮细胞表达许多参与抗原呈递的分子:移植抗原Ⅰ类(包括经典和非经典型的)、移植抗原Ⅱ类［13］。肠上皮细胞能与免疫系统其他细胞相互作用，参与对微生物入侵的炎症反应。人类肠上皮细胞能表达一种重要的脂多糖结合分子CD14，和TLR 一起维持肠道自身和环境之间的复杂平衡［14］。而且这些细胞能释放CD14 分子的可溶性形式，有可能参与黏膜免疫系统和肠道细菌间的相互作用。

微生物还能调节肠道杯状细胞分泌黏蛋白。黏蛋白可直接黏附于病原菌抑制肠道感染［15-16］，使黏膜免受胃酸和十二指肠液损伤。黏膜层能通过使细菌固定部位和抑制过度的免疫反应促进共生，而细菌产物的扩散可增加宿主-共生菌或共生菌-共生菌的相互作用。

3 肠道微生物群和适应性免疫系统

肠道内另一个重要的免疫部分是固有层，存在大量的巨噬细胞、树突状细胞、T 细胞和分泌IgA 的B 细胞。获得性免疫应答主要发生在肠相关淋巴组织(PP结和肠系膜淋巴结)中。固有层B 细胞是有活性并能转化为产生IgA 的浆细胞。IgA 通过上皮层运输后分泌到肠腔。特异性肠上皮细胞即微褶皱细胞或M 细胞摄取肠腔内抗原，将其运输给特异性抗原提成细胞，如基底面的DCs［17］。

大部分细菌被巨噬细胞杀死，但那些被M 细胞运输到DC 的细菌可以存活数天。在健康个体，DC 摄取抗原，通过刺激初始T 细胞分化为效应细胞(Th1、Th2、Th17)或调节细胞(Tr1、Th3)的平衡，诱导T 细胞无应答，维持宿主对共生菌和食物抗原的耐受。固有层特异性DC 可通过细胞延伸，穿透固有层直接摄取抗原。DC吞噬抗原，表达CD103 后迁移到淋巴组织，将抗原分解成小肽，以抗原肽-MHC-Ⅱ类分子复合物形式表达后呈递给T 细胞，从而激活初始T 细胞，其增殖分化形成效应T 淋巴细胞。抗原被清除后，大部分效应细胞死亡，只留下小部分永久记忆细胞。当遭遇相似抗原时，记忆细胞能迅速增殖成免疫效应细胞。吞噬活抗原的DC迁移到肠系膜淋巴结，可诱导产生IgA 的浆细胞。大多数DC 定居在固有层，通过输入淋巴管迁移到肠相关淋巴组织。DC 细胞和淋巴细胞进入GALT 依赖特异的黏附分子(L-选择素、CCR7 和L-选择素受体、CCL21 相互作用)。DC 也决定免疫应答的性质:IL-2 的早期产生，有助IFN-δ、选择素、Th1 应答的产生;IL-1、IL-6 和IL-23驱动Th17 应答。未成熟DC 的相互作用或IL-10 和TGF-β 的表达能诱导调节T 细胞抗炎应答。在淋巴组织中，淋巴细胞胞质能改变黏附分子的表达，通过下调CCR7 和L-选择素的表达，丧失进入淋巴组织的能力，但同时产生新黏附分子，引导其向外周细胞的迁移，称为归巢。在此复杂系统中的一步或多步失效时，自身免疫或炎症性疾病可能发生。

微生物刺激能使免疫反应向Th1 极化，而缺乏微生物刺激则维持Th2 极化的免疫反应，这是特异性反应的特点［18］。短双歧杆菌可能激活肠道CD103+DC产生IL-10 和IL-27 诱导产生IL-10 的Th1 细胞［19］，然而，无菌鼠植入脆弱拟杆菌可恢复Th1/Th2 的平衡，通过诱导产生IL-10 的CD4+T 细胞阻止肠道炎症反应，这依赖于肠道DC 对脆弱拟杆菌多糖A 的识别［20］。

4 肠道微生物与特异性疾病

在过去的40 年里，过敏性疾病(湿疹、食物过敏、花粉热和哮喘)的患病率呈全球性增长。遗传易感性起着重要的作用，但患病率的增加比基因突变快的多。越来越多的证据表明肠道内环境因素，比如共生菌，对肠道免疫稳定的维持和破坏起重要作用［21］。肠道细菌群能诱导宿主免疫的成熟，其功能的突变会导致过敏性疾病的形成。这种突变来自与西方生活方式相关的环境改变，包括饮食变化、抗生素使用和其他药物如抗酸剂、质子泵抑制剂、非甾体抗炎治疗药物。1989年，Strachan 引入了卫生假说，儿童时期缺乏细菌群暴露会扰乱肠道细菌群组成，诱导后期生活中对无害抗原的异常免疫应答，形成慢性炎症疾病。早期生活中微生物群的暴露能改变Th1/Th2 的平衡，支持Th1 免疫反应。另一种理解认为抗炎免疫反应是黏膜和系统耐受形成的重要基础。调节性T 细胞(Treg 细胞)可调控免疫抑制，通过IL-10 和/或TGF-β1 的Th1 和Th2 反应，加强过敏性和自身免疫性疾病的发展［22］。健康婴儿和多种食物过敏婴儿十二指肠活检显示，占主导地位的黏膜异常不是Th2 异常而是受损的产生TGF-β 的调节性T 细胞［23］。肠道微生物对IgA 抗体应答发展的影响，有助于清除肠腔内病原菌和过敏原。事实上，肠道菌群对免疫系统的影响不仅与食物抗原有关，也与空气中过敏原和过敏性呼吸道症状的表现形式相关。Noverr 等［24］研究发现导致细菌和真菌菌群变化的抗生素治疗，会引起宿主的过敏性呼吸道疾病。此外，罗伊氏乳酸菌口服治疗能够抑制小鼠气道变应性反应［25］。这些结果支持过敏原致敏可能发生在肺外，并且涉及到宿主-微生物之间的相互作用。肠道可影响全身免疫系统和局部远处组织的炎症反应，如呼吸道。由于抗原摄入可以诱导对这种抗原的耐受(口服耐受性)，胃肠道可作为对吸入抗原形成耐受的“传感器”。诱导调节性T 细胞可转移到全身其他组织，如呼吸道。

5 肠道菌群和炎症性肠病

炎症性肠病(IBD)包括两类慢性肠道疾病:克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)。IBD 是一种多因素疾病［26］，涉及肠道微生物群［27］、免疫细胞的活性［28］、血管内皮［29］及结肠细胞紧密连接结构的改变［30］，导致肠道细胞的相互作用紊乱，形成IBD。即在遗传易感宿主中，对肠道微生物不恰当的炎症反应而发生IBD。以下实验可说明微生物在IBD 中的作用:(1)抑制微生物(使用抗生素或基因毒性药物);(2)添加微生物或微生物成分(益生菌、CPG-DNA、上清培养液);(3)使用益生元改变微生物组成;(4)对缺乏微生物信号受体的敲除动物研究，这些实验表明微生物和宿主的特异性相互作用［31］。微生物分子如脂多糖、肽多糖、鞭毛蛋白和细菌DNA，被肠道和/或免疫细胞特异性受体识别。这些识别受体包括Toll 样受体和NOD样受体。值得注意的是，在动物模型和人体中，这些受体(NOD2、TLR4 和其他诸如蛋白酶聚集结构域家族、CARD15)的基因多态性与IBD 的风险增加相关［32］。正常的肠道分泌各种具有抗微生物特性的肽，包括防御素、溶菌酶、抗菌肽和分泌性免疫球蛋白。防御素在潘氏细胞内合成，一部分释放到肠隐窝和上皮表面，后停留在黏膜层。多项研究显示回肠CD 的α-防御素表达下降，IBD 患者的结肠β-防御素的诱导衰减。通过使用现代分子技术采集粪便标本的报道显示:相比于对照组，在患有CD 和UC 患者的粪便中，黏膜相关的厚壁菌和拟杆菌的多样性减少，这两种菌以多种方式促进胃肠道健康。普拉氏梭杆菌(厚壁菌门家族的主要成员)刺激外周血单核细胞减少IL-12 和IFN-γ 的产生，刺激IL-10 的分泌。普拉氏梭杆菌或其上清液口服给药，减少了结肠炎TNBS(2、4、6-三硝基苯酸)的严重程度，并纠正相关微生态失调，使IBD 患者大肠杆菌的数量增加。从CD 患者中分离的大肠杆菌表达入侵黏膜的毒力因子。IBD 患者肠道菌群失调可加重疾病程度，因为异常的微生物与CD 患者脓肿的发生率相关，并且菌群失调的IBD 患者比那些菌群正常的患者更早接受手术治疗。

6 IBD 的治疗:益生菌

益生菌作为生物治疗可用于IBD 患者。其基本研究主要集中于作用机制:(1)某些益生菌株能通过肠细胞诱导抗菌肽的分泌，抗菌肽可被细菌或特异性潘氏细胞分泌，并能调节细菌进入黏膜的通路。研究发现CD 与防御素的缺乏相关，而益生菌能增加这些肽类，成为有吸引力的候选药物;(2)益生菌能增强肠屏障的完整性，肠道通透性增加被疑为IBD 发病机制的主要因素，益生菌似乎能使肠道通透性恢复正常，一些乳酸杆菌能抑制病原菌黏附诱导蛋白表达;(3)益生菌似乎有免疫调节作用，能刺激天然免疫和引导适应性免疫对Th1、Th2 或Th3(耐受)应答［33］。

益生菌已在动物模型和临床试验上进行了评估。益生菌的某些菌种能通过增强上皮屏障治疗IBD。VSL#3 治疗IL-10 缺乏患有IBD 小鼠，引起结肠生理功能和屏障完整性正常化，伴随黏膜层促炎细胞因子的减少，通过增强屏障完整性可溶性因子的分泌，显著改善组织炎症，在感染和炎症环境下，益生菌能增强肠上皮细胞间紧密连接的完整性［33］。因此，益生菌的移植能使免疫细胞产生对致病性细菌抗原的低暴露。Rachmiliewitz 等［34］发现在结肠炎葡聚糖硫酸钠模型实验中，益生菌的保护作用是通过黏膜TLR9 受体识别的DNA 来介导的，这种相互作用能增加内源性β-防御素和调节细菌生存的抗菌肽的产生。此外，VSL#3 作用于培养的肠上皮细胞，能导致跨上皮电阻抵抗的增加。混合益生菌还可促使肠上皮细胞成熟，诱导几种黏蛋白表达，导致微生物及其成分对上皮表面的黏附性降低。

综上所述，益生菌在未来治疗IBD 中可能扮演重要角色。针对患者细菌组成不同，治疗需个体化。更好的理解细菌与宿主间的相互作用及新技术的使用可能成为IBD 患者益生菌治疗有效的关键。

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