猪瘟活疫苗（兔源）组织毒生产及其贮存方法比较研究

鲁立柱/新疆农业大学动物医学学院 王燕平/新疆天康畜牧生物技术股份有限公司制药事业部

猪瘟活疫苗（兔源）组织毒生产及其贮存方法比较研究

鲁立柱/新疆农业大学动物医学学院 王燕平/新疆天康畜牧生物技术股份有限公司制药事业部

我国自1956年开始推广猪瘟兔化弱毒疫苗时，首先是取家兔的淋巴结和脾组织就地制造的湿苗， 随制随用。1958年研制成功冷冻干燥疫苗，适用于工厂化生产，时至今日仍然采用相同的生产工艺，猪瘟脾淋苗以其抗原性好，过敏率低，免疫后快速产生免疫力等优点深受广大养殖户的喜爱，但其组织毒生产工艺繁琐，人员工作量大，综合成本高等诸多缺点也限制了其产量。通过对生产经验的总结，从降低测温次数、提高组织收获量、增加组织保存期限三方面着手，降低生产成本，提高组织毒生产安排的灵活性，以达到保证产品质量的基础上有效提高疫苗产量的目的。

一、材料与方法

1. 材料。猪瘟病毒：猪瘟兔化弱毒，F0代猪瘟兔化弱毒（C株）冻干种毒购自中国兽药监察所提供；脾淋组织毒由本公司猪瘟生产组提供。试剂：注射用水，由本厂制水站提供；灭菌生理盐水、Hank's液、5%蔗糖脱脂牛奶和猪瘟耐热保护剂等自行配制，消毒后备用。实验动物：体重为2.0～2.5 kg健康的纯系加利福尼亚兔，未注射过兔瘟疫苗，基础体温应在39.3℃～39.7℃之间，且波动小于0.5℃，由新疆鄯善县绿洲兔业养殖场提供。

2.方法。

（1）生产病毒最佳接种量和收毒部位的确定方法。先将冻干毒种用灭菌生理盐水制成50倍稀释的乳剂，耳静脉注射家兔6只，每只1 ml。注射后按照规程规定的效力检验方法，选取热型反应为定型热的家兔3只，在温度下降后24 h内剖杀，以无菌手术采取家兔肝脏、脾脏、肠系膜淋巴结、颌下淋巴结，采毒时切勿剪破胃、肠、食道，以免污染。然后，将收获的组织分别碾磨，用灭菌生理盐水稀释成1×10-4、2×10-4、3×10-4兔体感染量/克的乳剂，耳静脉注射家兔2只，每只1 ml，按照规程规定的效力检验方法判定家兔热型。

（2）组织毒使用不同保护剂在不同温度下的保存期试验方法。将制备的兔瘟组织毒，称重，研磨，平均分成四份，分别使用灭菌生理盐水、Hank's液、5%蔗糖脱脂牛奶和猪瘟耐热保护剂制备成10倍稀释的乳剂。再以2.0×10-4兔体感染量/克作为实验标准，将各组试验样用灭菌生理盐水稀释成2.0×10-4兔体感染量/克的乳剂，各组试验样分别置于-70℃、-15℃、2℃～8℃环境贮存，于7日、30日、60日、90日、120日、150日分别耳静脉注射家兔2只，每只1ml。按照规程规定的效力检验方法判定热型反应，检查各试验样的基础病毒含量是否≤2.0×10-4兔体感染量/克。

二、结果

1．脾脏、肝脏、肠系膜淋巴结、颌下淋巴结组织生产病毒的收率比较。实验兔脾脏平均重量在2～3 g，在腹腔内胃大弯部，易于收获，且无其它组织粘连，收获中也不易产生污染，各方面条件都适用于组织苗的生产。肝脏质量大，平均在80～120 g是脾脏的2～40倍，而且收获容易，不易造成污染，重量大是其最大的优势，肠系膜淋巴结在腹腔内肠系膜中心位置，其平均重量在4～5 g，被大量脂肪组织包围，收获时不易剥离，不小心容易剪破肠道造成污染。颌下淋巴结位于皮肤与下颌骨之间，平均重量为0.3～0.5 g，体积过小收获时不易剥离，而且在宰杀兔子时，放血过程中容易切破此部位造成污染。表略

2.各组织不同稀释度热型反应判定结果。按照规程效力检验的方法，检测脾脏、肠系膜淋巴结、颌下淋巴结的病毒含量，经热型判断，结果良好，达到了生产要求的配苗标准，脾脏病毒含量最高，肠系膜淋巴结和颌下淋巴结稍低于脾脏，肝脏的病毒含量未达到生产配苗的要求。表略

3.各种保护剂保存的组织毒在不同温度下保存7日、30日、60日、90日、120日、150日后的病毒含量保持情况。根据病毒含量测定结果，生理盐水和Hank’s液保存的组织，只有在-70℃时能够维持组织病毒含量到150日以上。-15℃保存组织，生理盐水保存的组织病毒含量会迅速降低，Hank’s保存的组织病毒含量可以维持到60日，仍能达到配苗要求。猪瘟耐热保护剂和5%蔗糖脱脂牛奶保存的组织病毒在冷冻保存下，保存时间能够到达150 d以上。2℃～8℃冷藏保存，5%蔗糖脱脂牛奶保存的组织在第7日时病毒含量就已经不符合配苗要求了，猪瘟耐热保护剂保存的组织可以维持到120 d以上。表略

4.四种保护剂优缺点对比。对四种保护剂从保存效果和经济性、实用性方面对比分析，5%蔗糖脱脂牛奶，最适合在生产中使用，生理盐水和Hank's液虽然经济实惠，操作方便，对配苗影响也不大，对组织毒的保存效果不理想，不能达到长期保存组织毒的目的，猪瘟耐热保护剂，对组织病毒含量保存的很好，但价格较高，且容易凝固影响配苗，所以在生产中不便于使用，5%蔗糖脱脂牛奶，保存效果良好，其本身就是冻干保护剂，对于产品后期配苗冻干过程无影响。表略

三、讨论

猪瘟活疫苗(兔源)生产使用的组织毒，是热型判定为定型热反应和轻热反应的家兔的脾脏和肠系膜淋巴结，组织毒配苗要求是每头份疫苗组织含量不得少于0.01 g。每只家兔能够收获的组织量在7～8 g，按照配苗要求，每只家兔只能产出700～800头份疫苗。如果提高家兔的组织收获量，就能够提高疫苗的产量。脾脏和肠系膜淋巴结重量是有限的，不可能有太多的改变，因此发现和收取其它含毒组织是提高收获量的唯一途径。从结果可以看出脾脏、肠系膜淋巴结和颌下淋巴结都出现了较好的热型反应，达到了配苗要求。肝脏虽然重量较大，但病毒含量较低，未出现明显的热型反应，不能用于生产，颌下淋巴结的热型反应达到了配苗要求，可以作为生产用组织毒，一定程度上达到提高产量的目的。但颌下淋巴结重量较小，收获困难且容易造成污染，在大生产中为了收取这极少的一部分组织而冒着整批产品污染的风险，有些得不偿失。所以综上所述，脾脏和肠系膜淋巴结仍以病毒含量高，无菌收获操作简单等优点列为猪瘟活疫苗（兔源）生产的最佳组织原料。

根据生产要求，组织毒病毒含量≤2×10-4/克，方可用于配苗，猪瘟活疫苗（兔源）生产规程要求，新鲜组织毒存放时间不得超过15日。从实验结果可以看出四种保护剂保存的组织毒，存放在-70℃的，至150日都可以达到有效的病毒含量，-15℃保存的组织毒中，生理盐水组和Hank's液组在90日时病毒含量测定热型不合格，已经不能用于配苗。2～8℃保存的组织毒，除耐热保护剂组一直到120日仍然保持有效病毒含量外，其余三组于7日时病毒含量就已经不合格了。

分析以上结果，无论采取以上那种保护剂，贮存在-70℃的组织毒都能存放150日以上而不影响病毒含量，但在-70℃保存，限制性较大，成本高，不适于大生产使用，对于生产与检验用种毒应该是十分理想的保存温度。

-15℃是生产冷库普遍能够达到的温度，经济实用，使用5%蔗糖脱脂牛奶和猪瘟耐热保护剂的组织毒，在此环境下都能保存到150日以上且不影响病毒含量。猪瘟耐热保护剂保存组织虽然在2～8℃环境下保存150日以上，但使用耐热保护剂，成本较高，且耐热保护剂内含有明胶，冷藏保存容易使组织在容器内结成整块，不便于后期配苗使用，所以使用猪瘟耐热保护剂，虽然能取得很好的保存效果，但生产中运用难度较大。

综上所述使用5%蔗糖脱脂牛奶，在-15℃以下保存组织毒，在生产中应用，能取得最理想的效果，大大延长组织毒的保存时间。

略