正交试验优选灰兜巴粗多糖的提取工艺

谢美娜，范慧芬，陈朝喜，黄志宏

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

灰兜巴（HDB）又名闭口袋，是生长在海拔1 200多米以上的老茶树丛内一种洞穴红蜘蛛吐的丝巢，也有人认为是一种菌科植物[1-2]。赵劲航等人利用中药复方灰兜巴灌胃治疗糖尿病动物模型，发现该中药可降低血糖浓度、抑制体重减轻、控制尿量增加和加速糖代谢作用[3]。孟凡欣、郑丹等人的研究发现，灰兜巴多糖能够降低糖尿病模型小鼠血糖浓度，同时降低血液中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和尿素氮（BUN）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性[4-6]。刘艳的研究发现，灰兜巴治疗糖尿病的有效成分主要是多糖[7]。多糖提取方法主要有水提醇沉法、超声波提取法、酶解法和超临界流体萃取法等。酶解法操作较繁琐，超临界流体萃取法设备要求高，也不太适合强极性的多糖的提取[8]，超声波提取法虽然提高了粗多糖提取率，但提取物所含固体杂质增多[9-10]。此外，上述3 种多糖提取方法不便于进行工业化生产。笔者选择水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，结合灰兜巴粗多糖中多糖的含量测定，同时考察时间、温度和料液比3 个因素，通过正交试验选取最佳的提取工艺。

1 材料

灰兜巴购自四川省峨眉山市，晾干粉碎。95%乙醇、蒽酮等实验试剂均为分析纯。DU 800 可见-紫外分光光度计，美国贝克曼公司；旋转蒸发仪RE-3000，上海亚荣生化仪器厂生产；Eppendorf 离心机5804R，德国艾本德公司等。

2 方法

2.1 灰兜巴粗多糖的提取方法 利用中药多糖水提醇沉法，采用正交试验对灰兜巴多糖水提条件进行优化，并确定最佳提取方法[11]。称取粉碎后灰兜巴10 g 于三角瓶中，按照设计好的正交试验条件水浴提取，然后以5 000 r/min 离心15 min，上清液减压浓缩为原体积的2/5，在不断搅拌下缓慢加入3 倍体积的95%乙醇，4 ℃静置12 h，8 000 r/min（4 ℃）离心3 min，收集沉淀，经无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤，再置于真空干燥箱干燥得到灰兜巴粗多糖。利用硫酸-蒽酮法测定灰兜巴粗多糖中多糖含量。

2.2 正交试验 以温度、时间和料液比3 因素，每个因素选取5 个水平，选用L25（56）正交试验确定灰兜巴粗多糖最佳提取方法，水平因素见表1。

表1 正交试验因素水平

2.3 灰兜巴多糖含量测定 试验采用硫酸-蒽酮法检测灰兜巴粗多糖中多糖含量[12]。

2.3.1 标准曲线制定 精密称取干燥至恒重的葡萄糖10 mg，溶于少量蒸馏水后定容到100 mL，制成100 μg/mL 葡萄糖溶液。

称取0.2 g蒽酮溶于100 mL浓硫酸中制成2 g/mL蒽酮试剂。按表2 中顺序加入各试剂，蒽酮试剂要缓慢加入并在冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中。水再次沸腾后计时准确煮沸10 min，自来水冷却，室温放置10 min，以0 号管为空白对照，于620 nm 比色。以吸光度A为纵坐标，以糖质量（μg）为横坐标，制作标准曲线。

表2 硫酸-蒽酮法试剂

2.3.2 灰兜巴多糖质量测定 取灰兜巴多糖水提液1 mL 按2.3.1 中方法测吸光度，利用标准曲线查到多糖质量。由下面公式计算灰兜巴多糖提取率。

3 结果

图1 葡萄糖标准曲线

3.1 葡萄糖标准曲线 葡萄糖标准曲线线性方程为y=0.0041x+0.0754，线性相关系数为0.9998，葡糖糖在0 到80 μg/mL 与吸光度线性关系良好。

3.2 正交试验 利用L25（56）正交试验，每个试验平行3 次，以灰兜巴多糖提取率为结果。L25（56）正交试验设计和结果见表3，对正交试验进行方差分析结果见表4。从表3 中极差分析可知各因素对灰兜巴多糖提取率的影响顺序为A(温度)＞B(时间) ＞C(料液比)，说明温度对灰兜巴多糖提取率影响最大，时间其次，最后是料液比，从表4 方差分析表中F 值可知温度对多糖提取率影响显著。由正交试验结果均值可知最佳试验组为A4B3C2，即最佳提取工艺是提取温度90 ℃，提取时间为1.5 h，料液比为1∶10。

3.3 验证试验 以正交试验所得的灰兜巴多糖最佳提取工艺来进行验证试验。3 次平行试验结果平均值为1.305%，RSD值为0.575%（n=3），无显著性差异。

表4 灰兜巴水提物正交试验方差分析

4 讨论

灰兜巴水煎液是四川峨眉地区治疗糖尿病的一个民间偏方，且效果良好。赵劲航等人用灰兜巴治疗链脲佐菌素或四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠和小鼠模型，通过对模型动物的血糖、耐糖量、尿量和体重测定，证实灰兜巴对糖尿病有治疗作用[3]。孟凡欣的研究表明，灰兜巴多糖具有明显的降糖作用，主要是通过清除体内氧自由基，降低MDA含量起到降糖作用[4]。但是关于灰兜巴治疗糖尿病的具体机制尚不明确，是以后灰兜巴治疗糖尿病的研究重点。

表3 灰兜巴水提物正交试验设计和结果

本试验利用传统的多糖提取方法即水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，通过硫酸-蒽酮法检测灰兜巴多糖含量。由硫酸蒽酮法标准曲线可知多糖在0～80 μg/mL 具有良好的线性关系。利用L25（56）正交试验，通过温度、时间和料液比3 个因素，每个因素5 个水平全面考察其对灰兜巴多糖提取率的影响。结果显示，试验组A4B3C2 的多糖提取率最高，即最佳提取工艺是提取温度为90 ℃，提取时间为1.5 h，料液比为1∶10。以提取温度90 ℃，提取时间1.5 h，料液比1∶10 的最佳工艺进行3 次验证性试验，所得结果无显著性差异，可知该最佳提取方法稳定可行。

陈燕忠等提取灰兜巴多糖试验中，未考察温度因素[11]。张琳华[12]、林志銮[13]和刘长建[14]等人在研究中药多糖提取工艺时，均以温度做为一个考察因素，结果也显示温度在正交试验中比其他因素影响显著。温度对多糖提取影响显著，可能是温度过低造成多糖提取不充分，温度过高可以破坏多糖化学结构，从而影响多糖提取率和药物效果。本试验中选择提取温度、提取时间、料液比3个因素，每个因素设5 个水平，全面考察温度、时间、料液比对灰兜巴多糖提取率的影响，为以后对灰兜巴多糖的进一步研究奠定基础。

目前，多糖提取方法主要包括水提醇沉法、超声波提取法、酶解法和超临界流体萃取法等。多糖超声波提取法比水提醇沉法所得固体量较多，但是多糖提取量没有增加，可能因提取过程复杂，所得杂质增多，且超声波提取法没有水提醇沉法提取工艺成熟[9-10]。酶解法可以缩短多糖提取时间，增加多糖提取率，但是酶解法生产成本较高，操作较为繁琐[15]。超临界流体萃取技术具有提取率高的特点，所以在中药提取中应用越来越广泛，但是该技术对设备要求较高，也不适合强极性物质的提取[8]。本试验选择恒温水浴条件下，利用水提醇沉法提取灰兜巴粗多糖，该方法有耗时较长、消耗溶剂较多的缺点，但其工艺较为成熟，便于进行工业化生产。

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